2021 Fiscal Year Research-status Report
Analysis for composition of Kaposi's sarcoma associated herpesvirus-host hybrid complex and discovery for drug targets
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21K08509
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| Research Institution | University of the Ryukyus |
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Principal Investigator |
渡部 匡史 琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (60634326)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | がんウイルス / ヘルペスウイルス / カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス / ウイルス性転写開始前複合体 / 近位依存性標識法 / Deep-learning / Alphafold2 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
まず新規近位依存性標識法を用いた宿主性vPIC相互作用因子の同定に向け，ビオチン化酵素タグ(miniTurbo,APEX2)発現プラスミドおよび改変ウイルス作成に向けたタグ挿入カセット配列プラスミドを構築した．また，vPIC因子であるORF34またはORF66欠損ウイルス産生細胞に対して，近位依存性標識タグ付加ORF34またはORF66発現プラスミドを導入し，定常発現細胞を樹立した．
次にウイルス性vPIC因子の機能性領域の同定に向け，vPICのハブとして機能しうるORF34に着目し解析をすすめた．ヘルペスウイルスホモログ間での保存アミノ酸残基についてアラニン置換体を網羅的に作成し，各種検討を実施した．ORF34はZinc-finger構造のコンセンサス配列であるC-x-x-Cモチーフを保持しており，これらはホモログ間でも保存されている．このシステインに変異を導入したC256A,C259A変異体では他vPIC因子との結合能，ウイルス産生量，ウイルス後期遺伝子発現のいずれも著減していた．ORF34についてはそのホモログも含め，現在までに結晶構造解析などによる分子構造は解明されていない．しかしながら，2021年7月に公開されたDeep-learningによるタンパク質構造予測アルゴリズムAlphafold2を用いてORF34の構造予測を実施したところ，確度の高い構造モデルを得られた．このORF34タンパク質予測モデル上でC256,C259とさらにC170,C175が配向性を持って存在し，これら4つのアミノ酸でZinc-finger構造と同等の2価イオン保持構造を取りうることが示唆された．C170,C175もまた，他のヘルペスウイルスホモログとの保存アミノ酸残基であり，C170AおよびC175A変異体も同様に解析を実施しており，C256AおよびC259Aと同等の挙動を示していた．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
宿主性vPIC相互作用因子の同定については，研究進展に不可欠なビオチン化酵素タグ付加vPIC因子を保持するKSHV BACクローンの構築に時間を要している．これに関しては引き続き継続して構築に取り組んでいる．また，本年度樹立したORF34欠損ウイルス産生/ビオチン化酵素タグ付加ORF34定常発現細胞，ORF66欠損ウイルス産生/ビオチン化酵素タグ付加ORF66定常発現細胞については，現在ビオチン化酵素タグによる複合体形成阻害による機能阻害が起きていないか，また細胞内でのビオチン化が十分に生じているか検証を実施中である．また．ビオチン化タンパク質の分離・精製についても試行を重ねている状況である．
ウイルス性vPIC因子の機能性領域の同定については，ORF34に関しては前述の通り概ね順調に進捗している．本年度中，早い段階での論文投稿へ向け原稿を準備している．
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| Strategy for Future Research Activity |
宿主性vPIC相互作用因子の同定については，ビオチン化酵素タグ付加vPIC因子を保持するKSHV BACクローンの構築に注力し，そののちにタグ付加によるウイルス産生への影響の有無を速やかに検討する．今年度樹立したビオチン化酵素タグ付加ORF34/ORF66導入細胞群についても同様である．また近位依存性標識法によるビオチン化タンパク質の分離・精製についても，他のウイルス性因子を用いた予備実験に取り組み，実験手法を予め確立しておくことで，迅速に今後の研究展開に対応したいと考えている．
ウイルス性vPIC因子の機能性領域の同定については，長年取り組んできたWetでのウイルス学的手法とAIアルゴリズムAlphafold2を利用したDry解析を組み合わせることによって，進捗を得ている．しかしながら，複合体形成阻害のシーズへとつなげられるような，他のvPIC因子の結合領域にはまり込む鍵となりうる構造や，結合領域をマスクするような構造の同定には至っていない．Alphafold2は公開以降もアップデートを重ねており，現時点での最新版では正式に複合体構造予測にも対応している．これを利用して，予測構造をもとにWet実験を展開するデータ駆動型の研究も進めたいと考えている．具体的には，タンパク質間で接触している構造を予測モデルから抽出し，実際に複合体形成阻害効果を得ることができるのか検討していきたい．
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| Causes of Carryover |
[次年度使用額発生理由] 前述した通り，当初予定していたビオチン化酵素タグ付加vPIC因子を保持したKSHV BACクローン構築に難航していること，および ORF34の機能性領域の同定について進捗が生じたためエフォートを割いたことにより，予算配分の高いビオチン化タンパク質のLC-MS/MS外注解析費等が発生しなかったためである．
[次年度使用額使用計画] 初年度に生じた余剰金は，今年度本来使用するはずであった外部依頼解析費用(その他)を中心に充当する予定である．またさらに余剰が生じた場合は，英文校正費・投稿料(その他)，研究試薬等購入費用(物品費)などに充当する．
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Research Products
(4 results)
