人工miRNAスポンジを用いた抗デングウイルス薬の開発

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K08512
• Research Institution: Dokkyo Medical University
• Principal Investigator: 石川 知弘 獨協医科大学, 医学部, 講師 (40609327)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: デングウイルス / 人工miRNAスポンジ / フラビウイルス / 抗ウイルス薬

Outline of Annual Research Achievements

デングウイルスは広く熱帯・亜熱帯地域に分布し、感染するとデング熱や重症病態であるデング出血熱を引き起こす。毎年1億例のデング熱、50万例のデング出血熱が発生していると推定されるが、特異的な抗ウイルス薬は認可されておらず、未だ開発段階である。本研究課題は人工miRNAスポンジ技術を用いた新規抗デングウイルス薬の開発・評価を試みるものである。
初年度はデングウイルスの増殖促進に関与する宿主由来miRNAの探索とその評価を実施した。既報でデングウイルスの増殖促進因子として報告された2種のmiRNA（miR-21a、miR-146a）について実際に増殖促進効果が認められるかをヒト肝細胞由来HepG2細胞とヒト慢性骨髄性白血病細胞由来K562細胞を用いて評価した。デングウイルス感染細胞にmiRNAを導入し培養液中のウイルス力価を評価した結果、いずれの細胞種においても感染48時間後のmiRNA導入群のウイルス量が増加したことから、これらのmiRは人工miRスポンジの吸収対象として利用可能であることが示された。
また他の候補miRNAの探索を目的とし、デングウイルス感染K562細胞内でのmiRNAの発現量について網羅的解析を実施した。その結果、非感染K562細胞と比較して有意に発現量が増減したmiRNAが134種同定された（有意に増加したものが76種、減少したものが58種）。またこのうち、これまでに報告されていない新規のmiRNAが96種含まれていた。これらのmiRNAの中でデングウイルスの増殖促進に機能するmiRNAが含まれているかどうか現在解析を進めているところである。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

miRNA発現の網羅的解析の実施にあたり、解析先の選定・打ち合わせ等に当初想定していたよりも時間が掛かったため、それらのデータ取得が少し遅れたが、概ね予定通りである。ウイルス増殖への影響はデングウイルスの全血清型について実施する予定であるが、現状1血清型でのみ実施しているところであり、早急に他血清型についても実施予定である。

Strategy for Future Research Activity

今後はデングウイルス全血清型に対し、増殖促進効果のあるmiRNAが存在するかどうかを探索し、人工miRスポンジの標的miRNAの選定を進める。2022年度後半には人工miRスポンジの作製を開始する。その際、標的miRNAが1種であれば、その相補配列を複数コピー有するように設計し、1種に絞り込めない場合は複数種のmiRNAの標的は配列を有す人工miRスポンジとする。作成後は各種培養細胞においてその抗ウイルス効果を確認する予定である。抗ウイルス効果の判定についてもデングウイルスの全血清型について実施する予定である。また必要に応じてサブゲノミックレプリコンを用いた評価を実施する。人工miRスポンジの培養細胞への導入方法についても検討を実施する。通常のトランスフェクション法やエレクトロポレーション法による比較検討に加えてウイルス様粒子による導入法についても評価を予定している。

Causes of Carryover

当初の計画ではデングウイルス感染細胞におけるmiRNA発現の網羅的解析を複数の細胞種を用いて実施する計画であったが、本解析の開始が想定より遅くなったため、本年度は1種の細胞でのみ実施したため次年度使用額が生じている。他の細胞種を用いた本解析を2022年度に早急に実施し、候補miRNAについてデングウイルス増殖促進効果の有無を評価する予定である。