2023 Fiscal Year Research-status Report
人工miRNAスポンジを用いた抗デングウイルス薬の開発
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21K08512
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| Research Institution | Dokkyo Medical University |
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Principal Investigator |
石川 知弘 獨協医科大学, 医学部, 講師 (40609327)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | デングウイルス / 人工miRNAスポンジ / フラビウイルス / 抗ウイルス薬 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
デングウイルスは熱帯・亜熱帯地域に広く分布する蚊媒介性フラビウイルスの1種で、感染するとデング熱や重症病態であるデング出血熱を引き起こす。毎年1億例のデング熱、50万例のデング出血熱が発生していると推定されるが、特異的な抗ウイルス薬は認可されておらず、未だ開発段階である。
本課題は、人工miRNAスポンジを用いた新規抗デングウイルス薬の開発・評価を実施するものである。これまでの研究で、既報のmiRNAに加え、本研究課題で同定したmiRNA（miR-Exo-69）がデングウイルス全血清型に対し増殖促進能があることを見出している。
本年度はこれら候補miRNAの相補配列のリピート配列（4～5回）をコードするベクターを構築し、得られたRNAを環状化し人工miRNAスポンジとしてウイルス複製の抑制効果を評価した。その結果、全ての人工miRNAスポンジで抗ウイルス作用が確認された。また細胞内での安定性を高める工夫としてin vitro transcriptionの際にシュードUTPを用いた転写産物を用いた人工miRNAスポンジを作製し、比較解析を行ったが、シュードUTPを用いた人工miRNAスポンジは通常のUTPを用いたものと比して抗ウイルス作用は低かった。そのため、人工miRNAスポンジの作製には通常のUTPが適していることが明らかになった。
しかしながら、当初のプロトコルでは環状化の効率が高くなく実験に供する人工miRNAの収量が著しく少量となることが問題であった。そこで、各反応条件の詳細を検討するとともに発現ベクターを高コピープラスミドに変更することで収量を改善できることを見出した。現在、これら人工miRNAスポンジを用いた全デングウイルス血清型に対する抗ウイルス作用の評価を実施しているところである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
人工miRNAスポンジの合成過程で環状化の効率が非常に悪く、その最適化に時間を要しているため。改善のために環状化をガイドする短鎖DNAを導入するなど種々の方策を検討した。その結果、発現ベクターを高コピープラスミドに変更し、環状化温度と反応時間の変更により収率は改善した。高収量の人工miRNAスポンジを得られていなかったので、抗デングウイルス薬としての評価を大規模に実施することが出来なかった。現在は収量が改善したため、抗デングウイルス作用の評価が実施可能となると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
各種条件検討により人工miRNAスポンジの収率が改善したため、本法を用いて4種の人工miRNAスポンジを合成し、デングウイルス全血清型に対する抗ウイルス作用の評価を実施する。また、1分子に複数種のmiRNA標的を有す人工miRNAスポンジについても合成を試みる予定である。合成に成功すれば単純に4種の人工miRNAスポンジを混合する場合との比較解析を実施する予定である。
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| Causes of Carryover |
人工miRNAスポンジ作製のためのRNA環状化反応の効率が悪く、充分な試料を得ることが困難であったために研究の進度が低下した。現在は種々の反応条件等の見直しにより収量を改善できる見込みが立った。本法を用いることで十分量の試料を用意することができ、作製した人工miRNAスポンジについて全血清型のデングウイルスに対する抗ウイルス作用の評価を実施する予定である。
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