Analysis of molecular mechanisms of metabolic disorders caused by de-coupling Glucose/Fructose metabolism.

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K08542
• Research Institution: National Center for Global Health and Medicine
• Principal Investigator: 満島 勝 国立研究開発法人国立国際医療研究センター, その他部局等, 分子代謝制御研究部上級研究員 (40621107)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: AldolaseB / フルクトース不耐症 / 低血糖 / 肝糖新生

Outline of Annual Research Achievements

1.AldolaseBノックアウトマウスの解析
本年度は、AldoBKOマウスの代謝表現型について解析を行った。フルクトース除去食飼育条件下で経口ブドウ糖負荷による耐糖能試験、インスリン皮下投与によるインスリン感受性試験、また肝糖新生能を皮下投与によるピルビン酸負荷試験、グリセロール負荷試験、グルカゴン負荷試験をそれぞれ行った。驚いたことに、AldoBKOマウスでは耐糖能が改善しており、初期血中インスリン値に変化がないことからインスリン感受性の改善が推測された。予想通り、インスリン感受性試験によりAldoBKOマウスではインスリン感受性の改善がみられた。また、グルカゴン負荷試験では両群には大きな差が見られなかったが、糖新生基質を投与した場合においてAldoBKOマウスでは血糖上昇が抑えられていた。この可能性として、①AldoBが糖新生の重要な酵素として機能すること、②インスリン感受性の改善により糖新生が抑制されたこと、などが考えられた。また、絶食時肝臓における様々な遺伝子の発現をq-PCRにより確認したところ、AldoBKOマウスの肝臓では摂食時に発現が高い多くの遺伝子がコントロールに比べ高い発現を示していた。このことは、AldoB欠損により絶食肝においてもインスリン応答性遺伝子の発現が促進されていることを示唆するものであり、今後そのメカニズムを解析する予定である。
2.初代培養肝細胞を用いたフルクトース不耐症の解析
前年度にAldoBKOマウス由来の初代培養肝細胞を用いた解析より、フルクトース添加によって細胞内のATP減少、AMPK活性化、糖新生の抑制がみられたが、阻害剤実験よりAMPK活性化が糖新生抑制の原因ではないと考えられた。そこで、細胞内で蓄積がみられるF-1Pに標的分子の検討を行ったところ、AldoAがF-1Pと結合することが分かった。現在詳細な解析を行っている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究によってフルクトース不耐症のモデルマウスを確立し、その代謝表現型がヒトフルクトース不耐症と酷似していることを明らかにした。その分子機構を解析するため、初代培養肝細胞の採取法を確立し、フルクトース負荷によっておこる細胞内イベントとして、細胞内ATPの減少、F-1Pの蓄積とその標的としての残存するAldolaseであるAldolaseAの可能性を見出した。現在精製標本を用いてF-1PがAldolaseAと直接結合するかを解析するとともに、F-1PがAldolaseAや他の酵素の活性を変化させるか検討をしている。近年AldoBが直接Aktの不活性化に関与することが示されており、我々もAldoBKOマウスにおいてインスリン感受性の亢進が確認できていることから、その作用機序に関しても検討中である。また、AldoBKOマウスの絶食肝臓における遺伝子発現変化を制御すると考えられる鍵分子の一つを見出しており、今後その制御機構を明らかにする予定である。さらには、全身性のノックアウトマウスでは腸管や腎臓においてもAldoB遺伝子が欠損しているため、他臓器における効果を排除できない。そのため肝臓特異的AldoBノックアウトマウスを作製しており、現在AldoBF/Fマウスを樹立し、α1anti-trypsin-CreあるいはAlbmin-Cre-ERT2マウスとの交配により肝臓および時期特異的コンディショナルノックアウトマウスを樹立している。樹立次第、各種荷試験を行い肝臓の行けるAldoBの役割を明らかにする。
以上の理由より上記の評価とした。

Strategy for Future Research Activity

AldoB欠損によるフルクトース不耐症の分子機構を明らかにするため、初代培養肝細胞の採取法を確立し、フルクトース負荷によっておこる細胞内イベントとして、細胞内ATPの減少、F-1Pの蓄積とその標的としての残存するAldolaseであるAldolaseAの可能性を見出した。現在精製標本を用いてF-1PがAldolaseAと直接結合するかをBIACOREを用いて解析するとともに、F-1PがAldolaseAや他の酵素の活性を変化させるか検討をしている。また、条件検討ができればバイオアナライザーを用いてミトコンドリア機能の代謝解析を行う。さらに、イメージングプローブを用いて代謝状態の変化を経時的に解析する。また、生体における肝臓AldoBの機能を明らかにするため、AldoBFloxマウスの作製を行っている。現在AldoBF/Fマウスを樹立し、α1anti-trypsin-CreあるいはAlbmin-Cre-ERT2との交配により肝臓および時期特異的コンディショナルノックアウトマウスを樹立している。樹立次第、各種荷試験を行い肝臓の行けるAldoBの役割を明らかにする。同時に、フルクトース不耐症による成長遅延のメカニズムを検討するため、低フルクトース摂取条件のマウス肝臓での遺伝子変化、代謝物変化を調べる。