T細胞受容体レパトアからひも解くPD-L1陰性乳がん免疫誘導療法の機能解析

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K08594
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 岩本 高行 岡山大学, 大学病院, 助教 (40627238)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 倫理員会の承認 / 増量採血 / 試料・情報の提供 / RNA抽出

Outline of Annual Research Achievements

本研究では末梢血単核球細胞からT細胞レパトア解析を目的としている。研究課題名「乳がん化学療法におけるT細胞レパトアの検討」として、岡山大学病院を主幹とする多施設共同研究（福山市民病院、広島市立広島市民病院、）の研究体制で、研究計画書および同意説明文書を作成の上、当院倫理員会の承認を得た。その後、各施設でも各々倫理審査を受けていただき、承認を得た後、研究開始となった。本試験では２mlの増量採血が必要となるため、血液採取の手順書（１．PAXgene® RNA採血管に2mlの採血。２．採血管を静かに8～10回転倒混和。３．採血後-20℃で24時間凍結、-70～-80℃で保存）を作成し、各施設との共有をおこなった。採血のポイントは、術前化学療法（アンスラサイクリンおよびタキサンレジメン）前、アンスラサイクリン投与後、手術時の3点とした。また、令和3年度6月ごろより、委託解析先のタカラバイオ（株）と解析手順、サンプルの受け渡し、秘密保持、解析価格や時期の交渉をおこなった。その結果、令和3年度は検体の収集と血液検体からのRNA抽出までにとどめることとした。各施設から主幹施設である岡山大学病院については「他の研究機関への試料・情報の提供に関する記録」の文書を用いてし、血液検体の授受をおこなった。検体の採取を依頼した施設に、臨床検体輸送セットとして中箱（発泡スチロール箱）にドライアイスとサンプルをいれて、その発泡スチロールをUN規格BOXにいれたのち、宅配便での回収をおこなった。

岡山大学病院に一度全検体を回収ののち、タカラバイオ（株）に検体の転送をおこない、RNA抽出をおこない、冷凍保存をおこなった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

全体で22例の登録があり、すでに登録は完了している。血液検体の回収は、術前化学療法前、アンスラサイクリン投与後、手術時の3点を予定しており、令和３年度中に２１例（1例の病態進行に脱落は除く）から45検体の収集することができた。

検体の解析は、一度にまとめておこなったほうが、費用が安くなるために令和4年度以降に全検体収集後に1度にまとめておこなうこととした。

以上より、研究の進捗に関して、症例の登録、検体の収集に関しては予定どおり進んでいるが、解析に関しては費用面から令和4年度以降におこなうこととしたため、(2)おおむね順調に進展している。とした。

Strategy for Future Research Activity

令和4年度　検体の解析ならびに統計処理および解析結果生成を予定している。
以下の手順により検体の解析をおこなう。1.TCRA/TCRB領域増幅（SMARTer TCR a b Profiling Kitを用いた逆転写、CDR３可変領域全体と3’側の定常領域の一部を増幅）、2.ライブラリー混合、MiSeqシーケンス（磁気ビーズによるライブラリーの精製およびBioAnalyzerを用いたサイズ・濃度の測定、MiSeqによるTCRの網羅的シークエンス解析）、3.V(D)Jセグメント同定ならびにクローナリティ解析

以下の手順により統計処理および解析結果生成をおこなう。1.統計処理ならびに解析データの可視化、レパトア多様性の解析ならびに各種グラフの生成、2.シャノン指数よりレパトアの多様性の検討、3.シンプソン指数より特異性の検討、4.本体研究PD-L1陽転化と上記指数との関連を検討

令和5年度　学会発表、論文化および論文の投稿をおこなう。

Causes of Carryover

解析は分割ではなく、一度におこなったほうが費用が抑えられることが判明した。よって令和4年度以降に一度に全検体を解析をおこなうこととしたため。