Significance of neutrophil extracellular traps in the formation of pre-metastatic niches by exosomes

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K08602
• Research Institution: Jichi Medical University
• Principal Investigator: 大西 康晴 自治医科大学, 医学部, 准教授 (60377257)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 佐久間 康成 自治医科大学, 医学部, 教授 (10296105) ; 金丸 理人 自治医科大学, 医学部, 助教 (10625544) ; 北山 丈二 自治医科大学, 医学部, 教授 (20251308) ; 眞田 幸弘 自治医科大学, 医学部, 講師 (60406113) ; 大澤 英之 自治医科大学, 医学部, 講師 (60458271)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 好中球細胞外トラップ / エクソソーム / 肺転移 / 腹膜播種 / 好中球

Outline of Annual Research Achievements

In vitroの検討：マウスB16メラノーマ細胞と、皮下接種によって高率に自然肺転移をきたす亜株B16-F10の培養上清から超遠心法を用いてエクソソームを分離、抽出し、マウス大腿骨から採取した骨髄細胞に添加、4～24時間培養し、細胞膜非透過性核酸検出試薬SYTOXで染色してNETs誘導性を測定したが、顕著な差は認めなかった。そこで、マウス胃癌細胞YTN16と当科にて樹立した腹膜高転移株YTN16の培養上清からエクソソームを分離し、カゼイン腹腔内投与後に腹腔内に滲出した好中球を分離し、同様の方法でNETs誘導性を測定したところ、YTN16P由来のエクソソーム添加群でNETsの産生が若干上昇する傾向が認められた。
In vivoの検討：マウス大腸癌細胞colon26と皮下接種によって高率に自然肺転移をきたす亜株LuM1を皮下接種後、7、14、21日目の肺組織を採取し、抗 Gr 1 抗体で好中球を、 NETs をシトルリン化ヒストン３ (Cit-H3) に対する抗体で免疫染色にて検討したところ、LuM1では早期から肺におけるGr-1陽性の好中球の浸潤が強く、Cit-H3陽性のNETsがより豊富に存在している傾向を認めた。そこで、接種後7日目の血液を採取し、エクソソームを分離し、microRNAを抽出した。このサンプルを用いてアレー解析を行う予定である。また、LuM1を皮下接種後にNETsの産生を抑制することが指摘されているメトホルミンを経口投与し、21日後に肺転移の形成を調査したが、有意な差を認めなかった。また、転移組織中の免疫細胞を検討すると、CD8(+)T細胞とCD335(+) NK細胞の密度はやや増加傾向を認めたが、Gr-1(+)好中球とCit H3(+)のNETsの量には顕著な差を認めなかった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

当初、B16メラノーマと高転移株B16-F10由来のエクソソームにNETs誘導能に顕著な差があると想定していたが、予想とは異なり有意差を認めなかったため、候補microRNAを拾い上げる目的で別の細胞株を利用する必要があることが判明した。そこで、胃癌細胞YTN16と腹膜高転移株YTN16P2、大腸癌細胞colon26と肺高転移株LuM1を用いて解析することに取り組んでいる。いずれの実験系でも若干の差は検出できるが、好中球の分化、NETs産生に対してより顕著な差を認める実験系を見出すことが課題である。

Strategy for Future Research Activity

1. マウス大腸癌細胞colon26と肺高転移株LuM1、に加えてLewis Lung carcinoma (LCC)細胞、4T1乳癌細胞、YTN胃癌細胞、MC38大腸癌細胞などのマウス癌細胞の培養上清から超遠心法を用いてエクソソームを分離、抽出し、マウス大腿骨から採取した骨髄細胞、およびカゼイン腹腔内投与後に腹腔内に滲出した好中球に添加し、4～24時間培養し、SYTOXで染色してNETs産生を経時的に検討し、好中球の分化、NETs産生に対してより顕著な差がある細胞群を検討する。これらの細胞由来のエクソソームからmicroRNAを抽出し、GeneChip miRNA Arrayを用いて網羅的解析を行い、標的となるmicroRNAを数個選択する。これらのmicroRNAを委託作成し、その機能をIn vitroで解析する。
2. 健常マウスに上記の検討で選択したmicroRNAを連日投与し、末梢血中の好中球が増加するか？肺組織におけるGr-1陽性の好中球の浸潤、Cit H3陽性のNETsが増加するかを検討する。また、その個体にてcolon26を皮下接種、静脈内投与し、肺転移の抑制が見られるか？を検討する。さらに、その実験系にて該当するmicroRNA に対するanti-miRを投与し、肺転移が抑制されるかを検討する。また、NETs産生を抑制するCl-AmidineないしNETsを分解するDNase Iを投与し、肺転移が抑制されるか？を明らかにする。

Causes of Carryover

B16メラノーマと高転移株B16-F10由来のエクソソームを用いてNETs誘導能に差があることを確認した後に、網羅的解析を行う予定であったが、予想とは異なり有意な差を認めなかったため、今年度中により顕著な差がある実験系を決定した後に、繰越し分にて網羅的な解析を施行することにした。参加予定にしていた学会がオンライン開催となったため、旅費は執行していない。