2022 Fiscal Year Research-status Report
GONAD法を用いた乳がんゲノム複数変異導入モデルの作成及びシングルセル発現解析
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21K08644
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| Research Institution | Yamaguchi University |
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Principal Investigator |
渡邉 健司 山口大学, 大学研究推進機構, 助教 (50711264)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
諌山 慧士朗 山口大学, 大学研究推進機構, 助教 (30780887)
水上 洋一 山口大学, 大学研究推進機構, 教授 (80274158)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 乳がん / NGS / 体細胞変異 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
乳がんは、女性の罹患率第 1 位のがんであり、死亡者数は未だに上昇している。乳がんを含め、がんのゲノム DNA には、多くの体細胞変異が検出されており、がんの主要な特徴の一つである。近年、次世代シークエンサー (NGS) によるハイスループットシークエンス技術の発展により、多くの体細胞変異が検出されている。検出される体細胞変異は、腫瘍形成の促進、治療薬に対する耐性獲得に寄与するが、多くの変異遺伝子の機能は不明である。これまでの研究では、1 遺伝子に 1 カ所変異を有するシングル変異遺伝子についての解析が行われてきた。しかしながら、ほとんどすべてのがんゲノムには複数の変異が検出されており複数の遺伝子変異が腫瘍形成に重要であることが示された (Neil Vasan et al., Science, 2019)。本研究では、複数変異遺伝子の機能を明らかにし、乳がん治療の標的分子を同定するために、乳がんで検出された複数のがん遺伝子変異を導入した in vivo、in vitroモデルの作成を試みた。乳がんにおける複数変異遺伝子を検出するため、乳がん組織ゲノムDNAについて、次世代シークエンサーを用いた変異解析を行った。dbSNPデータベース上の SNPs を除去し、体細胞変異を検出
した結果、PIK3CA 遺伝子に複数変異が検出された。検出した変異はPIK3CA遺伝子において検出されたものが最も多かった。変異箇所の組み合わせを詳細に確認した結果、PIK3CA 遺伝子の中に、これまで報告されていない新たな体細胞変異の組み合わせを見出した。複数変異 PIK3CA の機能を明らかにするため、複数変異導入配列の作成を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、上記の目的を達成するために、以下の３点について明らかにする。①ゲノム編集技術を用いて乳がんゲノム DNA で検出された複数の遺伝子変異を細胞に導入し in vitro モデルを作成する。② Genome-editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery (GONAD) 法を用いてマウスに遺伝子変異を導入し、in vivo モデルを作成する。③ in vivo モデルで発生した腫瘍または、in vitro モデルについて single cell RNAseq (scRNAseq) を行い、クラスタリングしそれ
ぞれの変異導入細胞を比較することで、変異導入細胞特異的または、変異導入細胞間で共通した分子を検出する。現在①を進行中である。PIK3CA に検出された全ての変異の機能をスクリーニングするために、変異PIK3CAを発現する発現ベクターを作成した。作成したベクターを乳がん細胞株である MCF7 細胞に導入し、機能を調べたところ、一部のPIK3CA遺伝子変異についてWT導入細胞と比較し、明らかな細胞増殖が認められた。次年度は、機能変化が認められた変異について、PIK3CAノックインマウスの作成を試みる。
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| Strategy for Future Research Activity |
私たちは、複数変異遺伝子の機能を明らかにし、乳がん治療の標的分子を同定するために、現在、治療標的となりうる複数変異遺伝子の検出を試みている。NGS による変異解析を行った結果、PIK3CA 遺伝子に候補複数遺伝子変異を検出した。検出した複数変異の組み合わせパターンを検証した結果、新たに３パターンの変異の組み合わせを見出した。複数変異遺伝子の機能を確かめるため、PIK3CA 遺伝子配列に検出した変異を導入した。キャピラリーのシークエンサーにより、変異が導入されていることを確認した。乳がん細胞株である MCF7 細胞に変異遺伝子配列を導入し、細胞増殖への効果を確認し、細胞増殖を促進するPIK3CAを見出した。検出した全てのPIK3CA変異について機能を確認する。細胞増殖を促進する変異についてノックインモデルマウスの作成を行う。
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| Causes of Carryover |
複数変異遺伝子を導入した細胞の機能を検討するため、以下のような予算の使用を予定している。本年度に全てのPIK3CA変異の機能解析を終える予定であったが、目標達成に届かず、消耗品の購入を一部見送ったため、未使用額が生じた。未使用額で細胞培養用試薬: 細胞の培養に必要な培地やディッシュ等購入する。遺伝子・タンパク質解析用試薬 xCELLigence の専用プレート、抗体購入を予定している。遺伝子導入系試薬: エレクトロポレーション用試薬の購入を予定している。PIK3CA変異の機能解析が終了後、変異ノックインマウス作成のためのオリゴDNA、guideRNAの作成費用、scRNA-seq解析用試薬 (Library): scRNAseq用のライブラリー作成用の逆転写酵素、精製ビーズなどの購入を予定している。
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