2021 Fiscal Year Research-status Report

肺がんにおける癌関連遺伝子MYNNとp53の相互制御機構の解明

Research Project

Project/Area Number	21K08668
Research Institution	Okayama University
Principal Investigator	伊藤佐智夫岡山大学, 医歯薬学域, 助教 (30335624)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	堺明子岡山大学, 医歯薬学域, 助教 (60205698) [Withdrawn] 大内田守岡山大学, 医歯薬学域, 准教授 (80213635)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Keywords	MYNN / myoneurin / p53 / microRNA / Lung cancer
Outline of Annual Research Achievements	これまでに申請者は、マウス尾静脈接種実験を行い、MYNN過剰発現細胞では肺への癌細胞の浸潤および定着が亢進すること、MYNN発現抑制細胞では浸潤および定着が抑制されることを発見した。またMYNNとp53が直接結合していること、DNA損傷刺激によるp53の活性化でMYNNタンパク質量が減少すること、MYNN過剰発現でp53およびp21が減少すること、MYNN抗体を用いたクロマチン免疫沈降 (ChIP)でMYNNがいくつかのp53標的遺伝子の調節領域に結合することを発見した。まずp53によるMYNNの発現調節機構を転写制御および転写後抑制から検証した。p53の過剰発現に伴いMYNN mRNAは僅かながら減少がみられたため、MYNNの調節領域・遺伝子領域に存在するp53レスポンスエレメント (p53RE)を同定し、それらp53REをルシフェラーゼレポータープラスミドにクローニングする。p53-wtをもつA549・H460ヒト肺腺癌細胞に構築したルシフェラーゼレポータープラスミドを導入し、エトポシド等のDNA切断型抗がん剤でp53を活性化させた後、ルシフェラーゼ活性を計測した。その結果では有意差は確認されなかったが引き続き検証を行う。また、p53活性化に伴い発現誘導されるmicroRNA (miRNA)が報告されており、申請者は、これらmiRNAの標的配列をMYNN mRNA-3’UTR上で確認している。p53活性化後、miRNAの発現亢進をTaqMan miRNAアッセイで、MYNNタンパク質発現低下をウェスタンブロット法で検証した。miRNA発現ベクターとMYNN-3’UTRの標的配列（wt/mut）をもつルシフェラーゼレポータープラスミドをそれぞれ構築してルシフェラーゼ活性を計測した。その結果、1つのmiRNAによる転写後抑制が確認された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason レポーターベクターの構築やクローニングが順調に進みp53によるMYNNの発現調節機構の各検証実験を完了している。MYNN高発現細胞株を作成したので、MYNNによるp53発現調節機構の検証を進めている。
Strategy for Future Research Activity	p53によるMYNNの発現調節もしくはタンパク質分解機構の追試を行いつつ、MYNNによるp53の発現調節もしくはタンパク質分解機構の検討を予定通り行う。 MYNN抗体を用いてChIPシーケンス (ChIP-Seq)を行うため、サンプル調製を行い、ChIP-Seqによりp53の調節領域・遺伝子領域よりMYNNのコンセンサス配列の同定を試みる。 MYNNの過剰発現によるp53タンパク質レベルの減少がp53のユビキチン修飾によるものかウェスタンブロット法で確認する。細胞内でのp53分解メカニズムには、E3リガーゼであるMDM2が重要な役割を果たしているため、MYNNとMDM2との相互作用を検証する。またp53タンパク質の安定化と活性化は、ARFがp53とMDM2の会合を阻害することにより誘導されるため、過剰発現したMYNNがARFを抑制することも考えられる。このため、MYNNによるARFのmRNAの発現低下・MYNNがARFと結合することによる機能阻害を検証する。
Causes of Carryover	クローニング等を共通試薬を使ったこと、クローニングが順調に進んだため塩基配列確認のシーケンス反応や共同実験室の使用が少なくすることができたことで次年度使用額が生じた。翌年分として請求した助成金は予定した検証実験に用いる。繰り越した助成金分はMYNNとp53の共通標的遺伝子同定のためのSequential ChIP-seqの費用に使用する予定である。