CA19-9を標的とした共有結合DNAアプタマーによる膵癌新規治療法の開発

2023 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 21K08724
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 中村 透 北海道大学, 医学研究院, 助教 (70645796)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 平野 聡 北海道大学, 医学研究院, 教授 (50322813) ; 平岡 圭 北海道大学, 医学研究院, 客員研究員 (10719587) ; YANG JAY 北海道大学, 医学研究院, 客員教授 (60897619)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 膵癌 / CA19-9 / DNAアプタマー

Outline of Annual Research Achievements

当初、細胞表面糖鎖抗原CA19-9を標的とし膵癌細胞にsiRNA を選択的に導入する共有結合DNAアプタマーを開発し、K-rasG12D 遺伝子およびfibulin-3 遺伝子発現を抑制し、膵癌増殖抑制効果を検討する予定であった。実際、細胞表面糖鎖抗原CA19-9とDNAアプタマーの結合確認の際、糖鎖抗原CA19-9基質の入手が困難であった。また、CA19-9は血中分泌されるため、膵癌細胞へのAptamer結合効率が低下する可能性が考えられた。そこで、血中に分泌されない膵癌細胞の表面マーカーであるMUC1 isoformYに対するAptamerを利用した。①MUC1 isoformY選択的に細胞内に核酸を取り込むことが可能な共有結合DNAアプタマーの作成、②MUC1 isoformYを標的としたDNAアプタマーとsiRNAを結合したDNA aptamer-siRNAによるK-rasG12Dおよびfibulin-3 遺伝子発現抑制実験、①②を組み合わせた共有結合DNA-Aptamer-siRNAを用い、ヒト膵癌同所移植モデルマウスによる前臨床試験を施行する計画とした。膵癌細胞株のMUC1 isoformYの発現状況をWestern blot、RT-PCR、免疫染色で確認した。MUC1 isoformY陽性の細胞株に対するDNA aptamerの取り込み実験を行い、蛍光顕微鏡でDNA aptamerが取り込まれていることを確認した。次に共有結合DNA aptamer-siRNAの合成実験では、MUC1 isoformY targeting DNAアプタマーとsiRNAのキメラ（MUC1 isoformY-DNA aptamer-siRNA）を“sticky-bridge” universal linker approachで試行した。合成DNAアプタマーの5’側にsiRNA配列の UU末端とアニール結合する際に、DNAとRNAのキメラよるアニールの条件が整わず、MUC1 isoformY-DNA aptamer-siRNAの合成が不良であった。pHや電解質をバッファーの濃度で調整したが、未だ適正な条件を得ていない。研究期間終了までに良好な結果を提示できなかったが、今後も研究継続を行っていく。