肝細胞がん多段階発がんにおけるWNTパスウェイ活性化メカニズムの解明

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K08807
• Research Institution: National Center of Neurology and Psychiatry
• Principal Investigator: 緑川 泰 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター, 病院 総合外科部, 部長 (10292905)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 肝細胞癌 / WNTパスウェイ / ベータカテニン / E-カドヘリン / 細胞悪性度

Outline of Annual Research Achievements

これまでに8種類の肝がん細胞株についてßカテニンの遺伝子異常の有無をシーケンスによる確認し、以下の2グループに分類した。ベータカテニンmut: HepG2, Hep3B, PLC/PRF/5, HLE, ベータカテニンWT: Huh7, SH-Hep1
CDH1を強制発現させるために現在まで以下の実験を遂行している。すなわちCDH1の転写領域全長（2,807bp）をpCDH-EF1-T2A-Puro（レンチウィルスベクター）にサブクローニングした。今後は上記のベータカテニンmut の各細胞株にトランスフェクションすることによりE-カドヘリンの発現を誘導する。トランスフェクションの効率については48時間後に免疫染色によりE-カドヘリンの細胞膜への局在で判定する。CDH1発現によるベータカテニンの核内移行の影響についても、免疫染色によりトランスフェクション前後の細胞株を比較検討する予定である。
CTNNB1 mut過剰発現についてもベータカテニンmutを有する細胞株HepG2よりCTNNB1の全長（3,488bp）をサブクローニングした。トランスフェクションは上記の方法でベータカテニンWT細胞株に今後行う予定である。さらにこれらのDNA導入した細胞株についてsiRNAによりCDH1をノックダウンする。
上記で作成した肝がん細胞について、今年度中にRNAシーケンスによりWNT下流遺伝子の発現レベルの変化、WNTパスウェイの活性化を確認する予定である。
さらに、上記で作成した細胞株についてそれぞれカドヘリン発現の有無で細胞増殖能、細胞遊走能、細胞浸潤能などを比較し、肝がん細胞の悪性化について比較検討する予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

2021年度についての進捗状況は概ね研究計画通りである。

Strategy for Future Research Activity

2021年度で作成したベクター・細胞株を用いて、臨床検体を用いた次世代シーケンサーの結果について、そのメカニズムを解明する実験を2022年度で行って行く予定である。すなわち、ベータカテニンの変異に加えてE-カドヘリン変化というセカンドヒットが必要であるかどうか、さらに実際にWNT経路の活性化が起こることにより細胞の悪性度が増加して進行度の遅い早期肝がんから悪性度の高い進行肝癌へと移行してゆくかどうかについての実験をおこない、in vitroと実際の生体内で起きている肝がん進展のメカニズムの解明を行うとともに、その研究課程で明らかになるゲノム変化に着目して新規の肝がんに対する分子標的治療へと繋げてゆく予定である。

Causes of Carryover

コロナ流行の影響で学会の出張や論文作成にかかる費用の一部が余ったため。これらの研究費は最終的に成果の発表に使用する予定である。