Development of a novel lymphatic regeneration therapy by direct reprogramming

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K08833
• Research Institution: Asahikawa Medical College
• Principal Investigator: 齊藤 幸裕 旭川医科大学, 医学部, 客員准教授 (80540583)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: ダイレクト・リプログラミング / リンパ管 / 静脈

Outline of Annual Research Achievements

次世代再生医療であるダイレクト・リプログラミング（D-reP）技術を利用した、発生学的に同系列である静脈をリンパ管へと誘導するリンパ浮腫新規治療法の開発研究である。我々は先行研究においてスクリーニングの結果からD-reP因子としてProx1とVEGFR-3が候補となることを見出した。しかしD-rePが上手く誘導できたかを確認するためのマーカーとなる指標が必要である。そこでまずリンパ管内皮細胞（LEC）、伏在静脈内皮細胞（HSaVEC）、HUVECの３細胞培養系を用いて血管、リンパ管のマーカーとなる遺伝子発現について検索した。候補とした遺伝子は以下である；Prox1、HGF、Met、LYVE-1、Ets-1、Ets-2、VEGF-A、Sox18、VEGFR-3、TGF-b1、FoxC2、ANGPT2、VEGF-C。これらのうちに常にLECでHSaVECとHUVECの両方より高発現していたのはProx1、VEGFR-3、ANGPT2、LYVE-1の４遺伝子のみであった。先行研究より、Prox-1とVEGFR-3はD-reP因子として利用することとしているため、LECへの誘導についてはANGPT2とLYVE-1の発現によって確認することとした。さらにHSaVECにProx-1、VEGFR-3、Prox-1+VEGFR-3プラスミドを遺伝子導入しそれぞれの遺伝子が十分に発現するかをreal time PCRで確認した。その結果、GFP導入群に比較してこれらのD-reP因子候補遺伝子が５日目まで十分に発現していることを確認した。
今後はHSaVECにProx-1、VEGFR-3、Prox-1+VEGFR-3プラスミドを遺伝子導入し,マーカーとしたANGPT2とLYVE-1の遺伝子発現をreal time PCRで確認する。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

マーカーの同定、プラスミドの準備、発現確認と１年目の準備段階としては概ね順調に進んでいるものと考える。ただし恒常発現細胞株の樹立に難渋しているためこの方法が難しければ、一過性発現での実験で進めていく。心筋細胞での別実験の報告では概ね１週間の発現で心筋細胞を誘導できていたため可能であると考えている。

Strategy for Future Research Activity

１、HSaVECにProx-1、VEGFR-3、Prox-1+VEGFR-3プラスミドを遺伝子導入し,マーカーとしたANGPT2とLYVE-1の遺伝子発現をreal time PCRで確認する。
２、マトリゲルによる静脈内皮細胞からリンパ管内皮化誘導の表現型の確認
３、動物モデルによるD-rePの検証

Causes of Carryover

恒常発現細胞培養系の樹立ができなかったため、RNA-Seqに係る予算が執行されなかった。こちらについては次年度以降樹立され次第執行する。