Identification of circulating tumor cells in the blood of lung cancer patients with an innovative new device

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K08909
• Research Institution: Teikyo University
• Principal Investigator: 坂尾 幸則 帝京大学, 医学部, 教授 (00274605)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 出嶋 仁 帝京大学, 医学部, 助教 (00891201) ; 山内 良兼 帝京大学, 医学部, 講師 (30445390) ; 齋藤 雄一 帝京大学, 医学部, 准教授 (70384071)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: CTC自動分離転写装置 / CTC / リキッドバイオプシー / 光学顕微鏡検出 / 肺癌

Outline of Annual Research Achievements

1. (CTC検出デバイスの試作、改良 )本年度はスチレン樹脂製軟パッドを先端部に装着した加圧式CTC転写装置を試作した。、この改良でCTCの細胞形態を保存したまま、80%程度の高効率でスライドグラスへの転写が可能なシステムを確立した。肺癌患者検体でPap染色によりCTCの形態保存が良好であることを確認した。今回、自動分離装置でCTCを捕集した後の細胞の転写工程を自動化したことで、CTCの院内検査化が前進した。
2. (肺癌におけるCTCの臨床的意義) 23例の肺がん患者検体（肺静脈血: PV、肺動脈血: PAおよび末梢血: PB）を用いてCTCの臨床的意義の検討を行った。その結果、PV、 PAはPBに比べて有意にCTC数が多く、しかもクラスターCTCが多いことから遺伝子解析に有用でだと判明した。また血管侵襲はPA、PVともに認めた。
３. (CTCの遺伝子解析の検討) 第１に培養肺癌細胞を用いてサイトケラチン免疫染色によるCTC算定後にスライドグラスからDNA抽出を行うための発色法を検討した。その結果、2次抗体の標識としてPOXからALPに変更することにより、活性酸素によるDNA分解を防ぎ、高効率なDNA抽出が可能だと判明した。このDNAを用いてDropletデジタルPCR法による遺伝子変異解析法を確立した。次に肺静脈血(PV)を用いてCTCのEGFR変異について解析を行った。肺静脈血PVからCTCが検出できた8例を対象とし、7例にCTCが同定され、そのうち3例でEGFR変異が検出された。肺切除組織からのEGFR検査と結果が一致したのは6例、不一致は2例。検討症例のCTC数は３から１９５個で、CTC数１０個以上の症例で変異の検出が可能であった。このことから肺静脈血PVは遺伝子解析の可能な新たなリキッドバオオプシー検体となり得ると考えられた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究では１）CTC検出デバイスの試作・改良、２）肺癌患者におけるCTCの検出頻度、数の検討、３）CTCの遺伝子解析法確立の３項目について新たに検討した。1）に関しては従来は遠心機とスウィングロータを用いてカバーグラスで被覆した状態で遠心によりCTCをフィルターからスライドグラスに転写していた。しかし、細胞形態の保持不良、低回収率 (50-60 %)のため、今回新しい自動転写装置を試作・改良した。これまでに開発済みのCTC分離装置と組み合わせることにより、良好な細胞形態保存、高回収率 (>80 %)、光学顕微鏡での簡便・正確なCTC検出を達成した。またこれにより、CTCの分離と転写を半自動で行うことに成功し、省力化も達成した。２番目の２）肺癌におけるCTCの臨床的意義に関しては症例数が35例と少ないものの、末梢血PBではCTCの検出頻度は30%、CTC数は0から10個/mlと少ないのに対し、肺静脈血PVでは検出頻度は70%、CTC数も0から1000個/mlと多く、肺静脈血PVによるリキッドバイオプシーの有用性が確認された。３番目の３）肺癌におけるCTCの遺伝子解析に関しては検索した患者PV血は8例と少ないものの、そのうち６例でCTCの解析結果と切除組織からのEGFR解析の結果が一致した。不一致の2例のうち１例は陰性例であった。CTC数が０から１０個以下では本解析システムの検出感度を超えるため、変異が検出できない可能性が高い。従って現状ではCTC数が0個が大部分である末梢血のCTCの遺伝子解析はかなり困難であることが示唆された。シングルセル解析法など感度のさらなる改善と高コストのバランスの解決が今後の重要な課題である。

Strategy for Future Research Activity

今回の研究により、肺静脈血や末梢血から金属フィルターを用いて捕集したCTCをスライドグラス上に転写後、染色し、光学顕微鏡下にCTCを検出、さらにこのCTCからDNAを抽出し、遺伝子検査によるEGFR変異の検出に成功した。現在、本邦で開発された遺伝子解析が可能なCTC検出装置は多くても3－４機種(社)と思われるがこれらはいずれも蛍光染色でCTCを検出し、回収したCTCを高額な光学機器や光学センサーを駆使して単離してから遺伝子解析する高コストな方式を採用している。これに対し、我々の装置は現在病院の病理検査室で行われている遺伝子検査のための前処理の方法に準じて、スライドグラス上の組織の代わりにCTCからDNAを抽出するため、CTC数が一定数以上ある場合には簡便、低コストにCTCの遺伝子解析が可能な点が他方式にない優位な点であり、院内検査への応用の可能性を示唆する。今後３年程度をめどにCTCを院内細胞診として実用化することを目指す。
今回、改良型CTC自動分離・転写装置を用いて肺癌でCTCの検討を行なったが、大腸癌、胃癌、乳癌など他臓器の癌で報告されているように、肺癌においてもリキッドバイオプシーの本命である末梢血のCTC数が少ないことが判明した。このCTCの希少性が末梢血CTCのバイオマーカーとしての意義や遺伝子検査への応用性を乏しいものにしている最大の理由である。今回の2年間の研究では基礎実験及び臨床パイロット試験を含めたCTCの光学顕微鏡的検出と遺伝子解析という２つの機能を同時に解析できるシステムの確立に重点を置いたため、臨床例の検討数が４０例以下と少なかった。今後は本研究成果を基盤として、さらに数年をかけ臨床実証研究を重点的に行い（症例登録目標150例）、肺癌症例での臨床病期・予後とCTC数の関係やCTCを用いた遺伝子解析(EGFR/ALK他)の有用性の検証、切除標本との比較など臨床的な解析を重点的に検討を進めてゆく予定である。

Causes of Carryover

コロナの影響で手術数が減少し、予定検体数に届かなかったため。