2022 Fiscal Year Research-status Report
全脳虚血後海馬グリア細胞におけるTGF-β1/Smadシグナルの機能的意義の解明
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21K08927
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| Research Institution | Osaka Metropolitan University |
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Principal Investigator |
中島 崇行 大阪公立大学, 大学院獣医学研究科, 准教授 (30333644)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
竹中 重雄 大阪公立大学, 大学院生活科学研究科, 教授 (10280067)
近藤 友宏 大阪公立大学, 大学院獣医学研究科, 講師 (40585238)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | TGF-beta / アストロサイト / ミクログリア / 海馬 / 全脳虚血 / Smad |
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| Outline of Annual Research Achievements |
今年度はin vitro虚血模擬実験系でのグリア細胞における細胞増殖および貪食能について調べた。具体的にはニューロンーグリア共培養細胞に酸素/グルコース除去（OGD）処置を負荷することによって神経細胞を死滅させ、その培養上清を別に用意した混合グリア細胞に添加した。コントロール実験として、OGD未負荷のニューロンーグリア共培養細胞の上清を混合グリア細胞に添加した。細胞増殖は、OGD負荷ニューロン-グリア共培養細胞由来の上清をグリア細胞に添加してから１日後にMTTアッセイによって評価した。すると、OGD負荷培養細胞由来上清添加を受けたグリア細胞では、コントロールグリア細胞よりもMTTアッセイの測定値が高くなり、OGD負荷培養細胞由来上清にグリア細胞増殖誘導効果があると思われた。OGD負荷培養細胞由来上清によって誘導されるグリア細胞増殖へのTGF-β1（10mg/ml）の影響を調べたところ、TGF-β1はOGD負荷培養細胞由来上清誘導性のグリア細胞増殖を変化させなかった。TGF-β1（10mg/ml）はその下流シグナルであるSmadをリン酸化させる効果を有していた。一方、OGD負荷培養細胞由来上清誘導性のグリア細胞増殖へのTGF-βシグナル阻害剤であるSB525334（10mg/ml）あるいはP144の影響を調べたところ、いずれの薬剤もグリア細胞を減少させる効果を発揮した。SB525334およびP144によるグリア細胞減少効果はOGD負荷ニューロン-グリア共培養細胞由来上清添加の有無にかかわらず認められた。これらの結果はTGF-βシグナルがグリア細胞の生存に必要な因子であることを示唆する。貪食能についてはOGD負荷培養細胞由来の上清をグリア細胞に添加してから１日後に蛍光ビーズ取り込み能によって評価した。その結果、OGD負荷培養細胞由来上清は蛍光ビーズ取り込み能を変化させなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
OGD負荷培養細胞由来上清のグリア細胞増殖を調べる際の実験条件、すなわち、MTTアッセイによる測定を行う際の細胞密度の設定や、細胞に添加するTGF-β1の濃度条件の検討に手間取ったため、進捗状況が遅れている。特にTGF-β1はグリア細胞の増殖を抑制するという結果が過去に報告されているので、今回TGF-β1はOGD負荷培養細胞由来上清誘導性のグリア細胞増殖を変化させないという結論を出すことに対して躊躇したため、実験条件の検討や実験のやり直し等で時間を費やしてしまった。さらに、TGF-βシグナル阻害剤であるSB525334とP144がグリア細胞を減少させるという過去に報告例がない結果を見出し、その結果の再現性を確認することにも時間を費やしてしまった。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和5年度はこれまでに行ってきたin vitroの実験系を継続するとともに、ラット全脳虚血モデルを用いたin vivoの実験系を行う。
（１）初代培養グリア細胞を用いたin vitro虚血模擬実験
これまでの実験でOGD負荷培養細胞由来上清がグリア細胞におけるiNOS mRNAとIL-6 mRNAの発現レベルを上昇させる傾向にあることを認めている。今年度は、このグリア細胞におけるOGD負荷培養細胞由来上清誘導性iNOS mRNAとIL-6 mRNAの発現レベル上昇効果に着目し、TGF-β1がグリア細胞におけるOGD負荷培養細胞由来上清誘導性iNOS mRNAとIL-6 mRNAの発現レベル上昇にどのように影響するかについて調べる。また、新たに見出したSB525334およびP144のグリア細胞減少効果のメカニズムについて詳しく調べていく。これまでの実験で、SB525334およびP144誘導性のグリア細胞減少効果はグリア細胞死によって起こるのではないかと申請者は考えている。今後はこの細胞死がアポトーシスによるのか、あるいはネクローシスによるのかを含め、細胞死が誘導されるメカニズムについて解明しようと考えている。
（３）全脳虚血モデルラットを用いたin vivo実験
TGF-βシグナルが全脳虚血後のグリア細胞にどのように影響するかを調べる。具体的には、全脳虚血処置を施したラットの脳室内にSB525334およびP144を投与し、その後、これらのTGF-βシグナル阻害剤投与ラットと溶媒投与ラット間でGFAP陽性アストロサイトとIba-1陽性ミクログリアの出現数の変化を調べる。さらに、ラットの脳虚血を受けた後のラットの神経症状がSB525334およびP144によってどのように変化するのかについても調べる。
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| Causes of Carryover |
OGD負荷培養細胞由来上清のグリア細胞増殖を調べる際の実験条件の検討やTGF-β1のOGD負荷培養細胞由来上清誘導性グリア細胞増殖変化への影響とTGF-βシグナル阻害剤SB525334およびP144のグリア細胞減少効果の再現性の確認実験に想定以上の時間を費やしたことで、研究の進捗が遅れているため。
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