2021 Fiscal Year Research-status Report
アデノ随伴ウイルスを用いた痛みの遺伝子治療の基礎的基盤の構築
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21K08940
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| Research Institution | Asahikawa Medical College |
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Principal Investigator |
川田 大輔 旭川医科大学, 医学部, 客員講師 (30595773)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
神田 浩嗣 旭川医科大学, 医学部, 准教授 (00550641)
神田 恵 旭川医科大学, 医学部, 講師 (50516820)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 痛み / 遺伝子治療 / アデノ随伴ウイルス / ウイルスベクター / GABA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１．GABAの合成酵素であるGAD67の遺伝子（GAD1）を発現するアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを作成し、ラット初代培養脳細胞におけるGABA産生への影響を調査した。緑色蛍光タンパク質（GFP）もしくはグルタミン酸デカルボキシラーゼ1（GAD1）を、サイトメガロウイルス（CMV）、シナプシンⅠ（SYN）またはCMVエンハンサー融合SYN（E/SYN）プロモーター制御下で発現するAAVベクターを作成した。
２．妊娠17日目のラット胎児から脳細胞の初代培養を確立し、免疫染色により神経細胞の純度を確認した。次に、AAVベクターをラット初代培養脳細胞に投与し、48時間後に導入遺伝子の発現をqPCRで、培養液へ含まれるGABA量を質量分析法により定量した。GAD1を発現するAAVベクター（AAV-CMV-GAD1、AAV-SYN-GAD1、AAV-E/SYN-GAD1）の投与は、コントロールベクター（AAV-GFP-CMV）と比較してラット初代培養脳細胞におけるGAD1遺伝子発現を優位に増加させた。また、培養液中に含まれるGABA量はコントロールのものと比較して著しく上昇していたため、AAVベクターを用いたGAD1遺伝子の導入は、ラット初代培養脳細胞のGABA産生を促進していることを確認した。
３．動物実験においても、緑色蛍光タンパク質（GFP）もしくはグルタミン酸デカルボキシラーゼ1（GAD1）を、サイトメガロウイルス（CMV）、シナプシンⅠ（SYN）またはCMVエンハンサー融合SYN（E/SYN）プロモーター制御下で発現するAAVベクターを用いて神経組織へ遺伝子導入するかどうか検討を行った。ラットへのSYNまたはESYNプロモーターを持ったAAVベクターの髄注により、神経細胞への遺伝子導入およびヒトGAD1遺伝子の発現が認められた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究概要に記述した２および３より、SYNまたはESYNプロモーターを持ったAAVベクターは、神経細胞特異的な遺伝子発現を誘導し、ヒトGAD1の導入によってGABA産生を亢進することが明らかになった。また、in vivoにおいても、神経組織へ遺伝子導入することを明らかにした。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和3年度は、GABAの合成酵素であるGAD67の遺伝子（GAD1）を発現するアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを作成し、ラット初代培養脳細胞におけるGABA産生への影響を調査した。令和3年度後半から令和4年度にかけては、本研究をさらに進めるため作成したアデノ随伴ウイルスベクターを使用して動物実験レベルでの機能評価を行っている。予定通りに作成したウイルスベクターの機能評価を動物レベルで確認した後、疼痛モデルラットを用いてアデノ随伴ウイルスベクターを投与し、その鎮痛効果を評価する。ここまでの研究が概ね予定通りに遂行された場合、令和4年度後半以降にはアデノ随伴ウイルスベクターの鎮痛効果の分子生物学的メカニズムの解明を行い、実験と並行して成果報告のための学会発表ならびに論文執筆に取り組んでいくことを視野に入れている。本研究の成果を将来的には痛みの遺伝子治療の臨床応用に繋げていきたい。本研究は、研究代表者の他、分担研究者2名と役割を分担して進めてきているが、本研究の代表者と分担研究者に加えて、他の研究協力者と共に定期的にミーティングを行い、本研究が滞りなく効率的に遂行されるように努めていく。
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| Causes of Carryover |
本研究の情報収集や中間報告を行うために参加予定であった国内外学会への参加に関して、COVID-19の感染流行から2021年度は見合わせたために未使用額が生じた。
令和4年度はウイルスベクターの作成ならびに、作成したベクターの機能評価を動物レベルで行うため、試薬、ウイルスベクター作成キット、手術用器具、消耗品、実験動物（ラット）購入・飼育費などに充てる。また、中間報告として、国内外の学会にて成果報告することを考えているため、資料の収集、英文校正料や学会参加費（交通費・旅費を含む）に充てることを考慮している。
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