2022 Fiscal Year Research-status Report
NFATc4に焦点を当てた膠芽腫の壊死周囲微小環境の腫瘍幹細胞誘導能解析
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21K09152
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| Research Institution | Yamaguchi University |
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Principal Investigator |
崔 丹 山口大学, 大学院医学系研究科, 准教授 (40346549)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
池田 栄二 山口大学, 大学院医学系研究科, 教授 (30232177)
吉冨 千尋 山口大学, 大学院医学系研究科, 助教 (50819323) [Withdrawn]
田中 瑛 山口大学, 大学院医学系研究科, 助教 (60913936)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 膠芽腫 / 腫瘍幹細胞 / 低酸素 / 低栄養 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
膠芽腫は極めて予後不良な脳腫瘍であり、病態解明および根治できる治療法の開発は急務である。膠芽腫の治療抵抗性や再発の原因には腫瘍幹細胞がある。これまで我々は、膠芽腫の予後不良を規定する腫瘍細胞として、HIF-1α を発現するとともに幹細胞性質を示し静止期にある腫瘍細胞〔HIF-1α+ Sox2+/Nanog+ RNApIIS2P-/low（以下、H+S+/N+R-/low 細胞）〕（Sox2 およびNanog は幹細胞マーカー、RNApIIS2P は増殖期マーカー）を特定し、この細胞が低栄養・低酸素状態を特徴とする壊死周囲ニッチに特異的に存在することを明らかにした。また、ヒト膠芽腫細胞株U87を用い、「壊死周囲ニッチ」を模したスフェロイド（３次元）培養系において、上記のH+S+/N+R-/low 細胞が出現することを再現し、これらH+S+/N+R-/low細胞の一部にはNFATc4の共発現を伴っていることが示された。「壊死周囲ニッチ」に出現する膠芽腫の予後不良を規定するH+S+/N+R-/low細胞の誘導にNFATc4が関わることが、スフェロイド培養系において示唆された。
令和4年度は、ヒト膠芽腫細胞株U87を用いて、ヌードマウス脳に移植し、可視化できる実験系を作成した。方法として、まず、ヒト膠芽腫細胞株U87株にBLIV-MSCV-Luciferrase-EF1a-copGFP-T2A-Puro(BLIV2.0:Plasmid) を導入し、ルシフェラーゼおよび蛍光タンパクGFP(Luciferrase-GFP)を安定的に発現する細胞を樹立する。その後、Luciferrase-GFPを強制発現したヒト膠芽腫由来細胞株U87を平面培養（2次元）し、様々な個数の細胞をヌードマウス脳に移植し、IVIS Imaging Systemで経時的にモニターする。その結果、2.8x105個以上の細胞を移植すれば腫瘍が形成した。また、移植後の１日目から腫瘍を摘出した28日までIVIS Imaging Systemでモニターできることを明らかにした。さらに、Luciferrase-GFPを強制発現したU87でスフェロイドを作製し、ヌードマウス皮下に移植することも成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度の研究計画は、マウス脳への移植実験など今後の解析のための条件設定を行う計画であり、平面培養で可視化できる細胞を脳に移植する至適なIVIS Imaging Systemでモニターできる条件を得た。また、スフェロイドをマウス皮下に移植し、至適なIVIS Imaging Systemでモニターできる条件を設定した。スフェロイドのヌードマウス脳への移植実験はやや遅れているが、来年度の解析を順調に行うための条件設定は済んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後、「壊死周囲ニッチ」を模した条件下で培養したスフェロイドと通常条件下で培養したスフェロイドの腫瘍形成能を比較し、NFATc4の関与を解析する。実験系として、R4で確立したLuciferrase-GFPを強制発現したヒト膠芽腫細胞株U87を低酸素・低栄養条件下、または通常条件下で培養したスフェロイドをヌードマウス脳に移植し、IVIS Imaging Systemでモニター経時的に腫瘍形成を観察する。さらに、NFATc4をノックダウンし、低酸素・低栄養条件下で培養したスフェロイドをヌードマウス脳に移植し、予後不良な膠芽腫の病態へのNFATc4の関与を解析する予定である。
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