2022 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of the mechanism of malignant trait acquisition molecules in ependymoma induced by EphB4
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21K09171
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
淑瑠 ヘムラサビット 金沢大学, 医学系, 協力研究員 (10432113)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | Ependymoma / EphB4 / ephrin B2 / Western blot / malignant transformation / QRT-PCR / immunocytochemistry / 小児脳腫瘍 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
【目的】上衣腫は小児から若年成人の頭蓋内や脊髄に好発する脳腫瘍である。有効な化学療法はなく、開頭手術により全摘出を目指し、残存腫瘍があれば再発予防として放射線治療を行うことが現時点の標準治療であるが、治療無効例も存在する。新規治療法の開発のために上衣腫の生物学的特徴を明らかにする基礎研究が必要である。Eph受容体は膜貫通型の受容体チロシンキナーゼであり、エフリン(ephrin)と呼ばれる細胞膜に存在するリガンドと結合することによって両方向性の細胞内シグナルを伝達する。 EphA とEphBのサブクラスが 同定されており、様々ながんで悪性形質の維持に関与していると報告されているが、上衣腫についての検討はない。ヒト上衣腫手術検体およびヒト上衣腫から樹立した2種類の培養細胞株を用いた解析、動物実験からEphB4阻害による新規上衣腫治療の可能性を探る。
【方法と結果】上衣腫の手術検体及び2種類の上衣腫細胞株EP1NS, NGT118を使用した。EphB1, B2, B3, B4, B6, ephrin-B2を一次抗体としEnvision+ 法による免疫染色を行った。凍結検体と細胞株を用いたWestern blot, QRT-PCRを行った。凍結検体、細胞株におけるEphB4のmRNA発現は正常脳と比較し高値を示した。腫瘍組織のEphB4の免疫染色結果はWestern blot結果を支持する所見でした。また、NGT118は正常脳、EP1NSと比較しEphB4/ephrin B2が高発現し、EphB4/ephrin B2が誘導するシグナルとしてERK, STAT3の関与が示唆された。
【結論】上衣腫の悪性形質にEphB4, ephrinB2の高発現とERK, STAT3シグナルの関与が考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
上衣腫培養細胞株は増殖が遅く実験に必要な細胞を増やすために時間がかかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
EphB4シグナルメカニズムのさらなる解析を上衣腫細胞株で行う。培養細胞株を用いてsiRNAによるノックダウンによる細胞形態の変化、増殖抑制効果の有無を検討する。
それらの結果をふまえ動物実験によるEphB4シグナルによる抗腫瘍効果を検討する。
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| Causes of Carryover |
① 上衣腫細胞株NGT118, EP1NSにおけるEphB4の発現とリン酸化をWestern blotで確認する。② EphB4シグナルによる細胞特性の変化を解析する。増殖能はAlamar Blueを用いたproliferation assayにて評価する。siRNAによるEphB4のノックダウンに伴う形質の変化などをphalloidin stainingを用いて検討する。 ③ 細胞特性変化に関連するシグナル経路を探索する。④ ephrin-B2 Fc chimeraを用いて濃度依存性に下流のシグナル分子の発現量を確認する。⑤ 上記2種類の細胞株にてsiRNAノックダウン効率が良かった方を用いてshRNAを用いたstableな細胞株をマウス脳へ移植後、2～３週間後に摘出した標本をHE染色にて腫瘍の大きさの違いを比較、さらにEphB4, ephrin B2の腫瘍組織内での局在を評価する。上衣腫におけるEphB4の作用機序、作用部位を解明するとともに抗腫瘍効果を引き起こすシグナルを見出し、最終的に動物実験を行うことによって上衣腫に対する新たな分子標的療法の可能性探る。
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