2021 Fiscal Year Research-status Report
Translational control in skeletal muscle regeneration
| Project/Area Number |
21K09218
|
|---|
| Research Institution | Nara Institute of Science and Technology |
|---|
Principal Investigator |
椎森 仁美 奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 助教 (20833891)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
|
| Keywords | 骨格筋 / 翻訳制御 / CNOT4 / ユビキチン転移酵素 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
骨格筋筋線維の修復・再生過程は、運動機能のみならず個体の発生や恒常性維持に重要な役割を果たす。しかしながら、骨格筋修復・再生時における各素過程の分子基盤は未だ明らかではない。申請者はこれまでの研究から、遺伝子発現制御因子CCR4-NOT複合体の構成因子、ユビキチン転移酵素CNOT4がmRNA翻訳制御を介して、骨格筋修復・再生に機能する可能性を見出した。そこで、本研究では、骨格筋の修復・再生過程におけるCNOT4のユビキチン化標的因子とそれらによる翻訳制御機構の全体像を明らかにすることを目指して研究を進めている。
令和３年度は、マウス筋芽細胞C2C12の野生型及びCNOT4ノックアウト株を用いて解析を行った。まず、C2C12細胞を筋繊維へと分化誘導して、分化0, 2, 4日目の細胞を用いてmRNA発現及び翻訳状態をRNA-seq, Ribosome-profilingによって経時的に解析した。現在、得られた結果の詳細な解析を進めている。また、C2C12細胞の分化誘導時におけるユビキチン化タンパク質検出系の確立を進めている。内在性のユビキチン化タンパク質のpull-downが可能である人工タンパク質を用いて解析を進めている。C2C12細胞を用いた解析系の確立を目指すとともに、HEK293T細胞等のトランスフェクション効率が良い細胞を利用した翻訳関連因子のCNOT4依存的なユビキチン化状態の解析についても進めている。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
令和３年度は、マウス筋芽細胞C2C12の野生型及びCNOT4ノックアウト株を用いて解析を行った。まず、C2C12細胞を筋繊維へと分化誘導して、分化0, 2, 4日目の細胞を用いてmRNA発現及び翻訳状態をRNA-seq, Ribosome-profilingによって経時的に解析した。現在、得られた結果の詳細な解析を進めている。また、C2C12細胞の分化誘導時におけるユビキチン化タンパク質検出系の確立を進めている。内在性のユビキチン化タンパク質のpull-downが可能である人工タンパク質を用いて解析を進めているが、これまで発現レベルが低い内在のタンパク質については、そのユビキチン化は検出できていない。C2C12細胞を用いた解析系の確立を目指すとともに、HEK293T細胞等のトランスフェクション効率が良い細胞を利用した翻訳関連因子のCNOT4依存的なユビキチン化状態の解析についても進めている。
|
| Strategy for Future Research Activity |
令和４年度は、まずRibosome profiling解析で得られた結果の解析を進める。翻訳状態が変化した遺伝子群に関して、mRNAの配列的特徴、また、コードするタンパク質の機能的特徴があるか明らかにする。同定した特徴的な配列を挿入したレポータープラスミドを作成し、C2C12細胞に導入して、分化に伴う発現の変化を経時的に観察することにより、翻訳制御を受ける条件となるシス配列を同定する。さらに、同定したシス配列を持つRNAとどのような因子が相互作用するのか、まずin silicoでの解析を行う。候補因子が得られた場合には、C2C12分化時のレポーターmRNAと候補因子の相互作用をpull-down法により解析する。さらに内在のmRNAについても同様に、相互作用しているかどうか明らかにする。
また、CNOT4のユビキチン化標的タンパク質の同定を行う。まず、上述の解析で同定した制御因子がCNOT4依存的にユビキチン化されるか検証する。C2C12の野生型株およびCNOT4ノックアウト株において、ユビキチン化タンパク質のpull-downを行い、CNOT4依存的にユビキチン化されているか検証する。C2C12でのユビキチン化タンパク質の検出が上手くいかない場合は、他の細胞を用いた検討を行う。
以上の解析から、筋芽細胞から筋繊維への分化時に、CNOT4によるユビキチン化を介した翻訳制御機構について理解する。
|
| Causes of Carryover |
所属研究所の方針で新型コロナウイルス関連の研究を行う必要があり、本研究を行う時間がやや短くなったため、次年度使用額が生じた。令和４年度の解析に必要な遺伝子発現解析関連試薬の購入に充てる予定である。
|
