2022 Fiscal Year Research-status Report

シュワン細胞脱分化機構の解明と未分化シュワン細胞誘導による末梢神経再生の研究

Research Project

Project/Area Number	21K09273
Research Institution	Gifu University
Principal Investigator	平川明弘岐阜大学, 大学院医学系研究科, 特任准教授 (50422720)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	河村真吾岐阜大学, 医学部附属病院, 助教 (30456511) 秋山治彦岐阜大学, 大学院医学系研究科, 教授 (60402830)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Keywords	未分化Schwann細胞 / 末梢神経再生 / PI3K/Aktシグナル
Outline of Annual Research Achievements	坐骨神経損傷後のシュワン細胞脱分化におけるPI3K/Aktシグナルの関与を解析するため、Schwann 細胞特異的遺伝子改変マウス：Sox10-CreERT2マウスとPten flox（gain of function）マウス、Rosa26-stop-Pten（loss of function）マウスを交配し、Sox10-CreERT2/Pten flox/floxおよび、Sox10-CreERT2/Rosa26-stop-Ptenを作製した。同様にWnt/β-cateninシグナルの関与を解析するため、Sox10-CreERT2マウスとβ-catenin ex3 flox（gain of function）、 β-catenin ex2-6 floxマウス（loss of function）を交配し、Sox10-CreERT2/β-catenin ex3 flox 、Sox10-CreERT2/β-catenin ex2-6 flox/floxを作製した。 Sox10-CreERT2/Pten flox/floxマウスにタモキシフェンおよびcorn oil（コントロール）を投与後、坐骨神経損傷モデルを作製した。受傷後5日目、28日目に組織標本を作製し、分化シュワン細胞マーカー(Mbp)、未分化シュワン細胞マーカー（Ngfr）、軸索マーカー（TujI）による免疫染色を行った。その結果、シュワン細胞におけるPI3K/Aktシグナル亢進によって、シュワン細胞の脱分化が遅延することが示唆された。一方で、Sox10-CreERT2/Rosa26-stop-Ptenマウスにおいてはタモキシフェンを投与したが、Cre-LoxP反応が生じず、Ptenの過剰発現が誘導できなかった。また、Sox10-CreERT2/β-catenin ex3 floxマウスにタモキシフェンを投与したが、コントロール群と比較し、坐骨神経の再生には変化を認めなかった
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason Sox10-CreERT2/Rosa26-stop-PtenマウスのCre-LoxPシステムが作動せず、その原因究明に時間を要したため。また、Sox10-CreERT2/β-catenin ex3 floxマウスを解析したが、神経再生に変化を認めず、Wnt/β-catenin関連の動物実験を中止したため。
Strategy for Future Research Activity	In vivo実験表現型に差を認めたPI3K/Aktシグナルの解析を進めるため、Sox10-CreERT2/Pten flox/floxマウスを用いて坐骨神経損傷モデルを作製し、損傷後3日、5日、7日、14日、28日で坐骨神経損傷部のRNA、タンパク、組織標本を回収し、シュワン細胞の分化状態の変化、軸索伸長能を評価するとともに、下肢筋の神経再支配の程度をトレッドミル走行試験、下腿筋体積測定により評価する。 In vitro実験マウス坐骨神経からのシュワン細胞培養プロトコールを用いて、シュワン細胞を培養する。培養シュワン細胞にPI3K/Aktシグナル agonistおよびantagonistを投与する。RNA、タンパクを回収し、未分化/分化シュワン細胞マーカーの変動および神経成長因子の発現の変化を解析する。