2021 Fiscal Year Research-status Report

KLF15発現制御による変形性関節症に対する治療への挑戦

Research Project

Project/Area Number	21K09278
Research Institution	Kobe University
Principal Investigator	林申也神戸大学, 医学研究科, 助教 (20437487)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	橋本慎吾神戸大学, 医学研究科, 特命助教 (20457089) [Withdrawn] 中野直樹神戸大学, 医学部附属病院, 医員 (40884458) 松本知之神戸大学, 医学研究科, 講師 (50546588) 黒田雄一神戸大学, 医学部附属病院, 医員 (90884461)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Keywords	KLF-15 / 炎症 / 変形性関節症 / アポトーシス
Outline of Annual Research Achievements	本研究では炎症、アポトーシスの制御という観点からKLF-15の発現を調節することで関節組織に与える影響を、軟骨組織特異的KLF-15ノックアウトマウスに変形性関節症モデルを作成し解析を行うことで変形性関節症におけるKLF-15の役割を調べるために、タモキシフェン誘導型の軟骨特異的Creマウス（Col2a1-CreERT2 transgenic マウス）とKLF15-floxed/floxedマウスを交配させ軟骨特異的KLF-15ノックアウトマウス (Col2-CreERT2/ KLF-15flox/flox)を作成した。4週令の軟骨特異的KLF-15ノックアウトマウスに対して5日間連続でタモキシフェン腹腔内投与を行った後に10週でsacrifice、膝関節及び肋軟骨より回収した軟骨組織でノックアウト効率をrealtime PCRで測定するとノックアウト効率は80%程度であり他の報告と同等であった。このモデルに軟骨の研究分野では頻用され我々もこれまで用いているDMM (destabilization of the medial meniscus) モデルを作成した。 2.軟骨特異的KLF-/-, KLF+/+の2群に対しDMMモデル作成後1日、1週、４週、８週 sacrificeし組織を回収し以下の項目を検証した。a. 画像的評価　マイクロCTを用いマウス膝関節における関節症性変化を画像的に評価したところ8週でWTとKO群で有意にKOでのOA変化が増強した。b. 組織学的評価軟骨基質分解酵素 (MMP3,MMP13)、炎症関連マーカー (IL-1beta, p-IKK), アポトーシスのマーカーであるTUNEL染色行ったところKLF-15 KO群で、変形性関節症組織において軟骨基質分解、炎症、アポトーシスを介した軟骨組織異化作用が亢進した
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 研究年度1年目はconditional knockout mouseの作成（ノックアウト効率は80%程度）、及びin vivoでのOAモデルを作成し画像的ならびに組織学的に評価することであったが、軟骨基質分解酵素 (MMP3,MMP13)、炎症関連マーカー (IL-1beta, p-IKK), アポトーシスのマーカーであるTUNEL染色行ったところKLF-15 KO群で、変形性関節症組織において軟骨基質分解、炎症、アポトーシスを介した軟骨組織異化作用が亢進したという結果がすでに得られており概ね順調に研究が進んでいると考えられる。
Strategy for Future Research Activity	組織学的評価をさらに行う、Safranin O染色で形態学的評価（軟骨細胞数、細胞外基質量の評価、滑膜増殖の有無）軟骨基質分解酵素 (ADAMTSs)、炎症関連マーカー (CD86, CD163, p-IKK)、アポトーシス関連 (FOXO1) の免疫組織染色、さらにF4-80染色も行う。以上を評価することにより、KLF-15が変形性関節症組織において抗炎症効果、抗アポトーシス効果を介した軟骨組織保護作用を有するかを検証することができる。さらに令和4年度後半から5年度にかけてはin vivoでのKLF-15の効果を検証するために、作成した軟骨組織特異的KLF-15ノックアウトマウスの軟骨組織から軟骨細胞を単離培養し軟骨組織におけるKLF-15の分子生物学的検討を行う。軟骨組織特異的KLF-15ノックアウトマウスより単離培養した軟骨細胞をIL-1betaで刺激し、KLF-/-, KLF+/+の2群間で軟骨基質分解酵素やIKKなどの炎症関連物質の発現をqPCR, Western blot法で比較することで、KLF-15が軟骨組織保護及び抗炎症効果を有するかをin vitroで検証できる。