変形性足関節症におけるCCN3を介した新たな軟骨細胞老化制御機構の解明

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K09280
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 雑賀 建多 岡山大学, 大学病院, 助教 (30452577)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 服部 高子 岡山大学, 医歯薬学域, 助教 (00228488) ; 中田 英二 岡山大学, 医歯薬学域, 講師 (10649304) ; 二川 摩周 岡山大学, 大学病院, 技術職員 (10851636) ; 尾崎 敏文 岡山大学, 医歯薬学域, 教授 (40294459) ; 久保田 聡 岡山大学, 医歯薬学域, 教授 (90221936)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 足関節 / 軟骨 / CCN3

Outline of Annual Research Achievements

変形性足関節症 (osteoarthritis of the ankle; OA of the ankle)の患者では痛みや歩行障害により日常生活動作が著しく低下する。我々はOA関連遺伝子の探索を行い、軟骨組織の発生・分化・再生過程において多様な生理機能を持つCellular Communication Network Factor (CCN)フ ァミリー遺伝子のうち、CCN3がヒトから得られた関節軟骨細胞で加齢とともに有意に増加していることを認めた。また、酸化ストレス刺激により老化を誘導した軟骨細胞でCCN3 発現の上昇を認めた。そこで、これらの結果をもとに足関節においてCCN3が軟骨細胞の老化によるOAを促進するか検討し、足関節の軟骨細胞において、CCN3を介した加齢性変性に対する分子メカニズムを解明することを目的としている。

研究実施計画に基づき、足関節固定術や人工足関節置換術時に軟骨組織を採取し解析を行なっている。令和3年度は、まず並行して行なっている股関節軟骨研究を進めた。すなわち、Normal群とOA群を荷重部と非荷重部で分け、それぞれの組織をサフラニンOで染色した。肉眼的にOA群荷重部で明らかな軟骨層の菲薄化が確認できた。また、培養した軟骨細胞のmRNAをReal-time PCRを使用しCCN2, 3とADAMTS5で評価した。CCN3, ADAMTS5で荷重、非荷重関係なしにOA群で有意に上昇を認めた。また、両群において年齢との相関はなかった。さらに、組織より直接抽出した軟骨細胞のmRANを評価した。荷重、非荷重に関与することなくそれぞれの因子でOA群において有意に上昇を認めた。また、両群において年齢との相関はなかった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

変形性股関節症でCCN3が有意に上昇していたため、これまで我々がOAにおいてCCN3が上昇するという結果を支持しているものだと考えられた。OA群の非荷重部においてCCN3が有意に上昇し、荷重部においては両群間に有意差は認めなかった。また、全ての結果において年齢との相関も認めなかったことより、荷重に伴うメカニカルストレスや年齢に関与することなく変形性股関節症においてCCN3が変形性股関節症の発症に関与することが考えられた。今後は、これらの知見を参考にし、足関節軟骨についての解析を進めていく予定である。

Strategy for Future Research Activity

令和4年度は、申請者は研究分担者と共に足関節固定術や人工足関節置換術時に得た軟骨組織におけるCCN3の発現の程度を検討する。手術時の年齢、OAの程度等によるCCN3の発現の程度を比較する。RNAはReal-time PCR、タンパクはWestern blot法を用いて発現レベルを検討する。また、CCN3を軟骨組織特異的に過剰発現するマウスを作製する。
令和５年度は、申請者はCCN3過剰発現によるOAの進行を評価するため、軟骨細胞特異的CCN3過剰発現マウスとWild typeのマウスの足関節の軟骨組織を比較する。RNAはReal-time PCR、タンパクはWestern blot法を用い細胞老化指標(p16, p21)、基質産生(Col2a1, Agrecan)、基質分解(MM13, ADAMTS4/5)、炎症性サイトカイン(IL-6, IL-8)の項目について評価する。
また、これらの細胞から抽出したRNAを用いてRNA-Seq法を行い、発現が変動した遺伝子の網羅的解析を行う。網羅的解析の結果はクラスタリングして発現変動があった転写調節因子やシグナル経路を特定し、それぞれの分子機構を明らかにする。
得られた結果は取りまとめ、成果の発表を行う。

Causes of Carryover

並行して行っている股関節軟骨研究の解析に用いる物品費が予定より節約できたため、次年度使用額が生じたが、次年度実施する足関節固定術や人工足関節置換術時に得た軟骨組織におけるCCN3の発現解析の実験にかかる費用等に充当する予定である。