The role of novel activating ligand of receptor tyrosine kinase in nerve regeneration mechanism

2022 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 21K09297
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 町野 正明 名古屋大学, 医学部附属病院, 病院助教 (70807510)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 今釜 史郎 名古屋大学, 医学系研究科, 教授 (40467288) ; 安藤 圭 名古屋大学, 医学部附属病院, 講師 (40566973) [Withdrawn] ; 小林 和克 名古屋大学, 医学部附属病院, 病院講師 (00706294) [Withdrawn] ; 中島 宏彰 名古屋大学, 医学系研究科, 准教授 (70710101)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 受容体型チロシンキナーゼ / 神経再生 / 活性化リガンド

Outline of Annual Research Achievements

未分化リンパ腫キナーゼ（ALK）は、受容体型チロシンキナーゼ（RTK）ファミリーに属するI型膜貫通型タンパク質であり、その細胞内チロシンキナーゼ活性は、特定のリガンドによる受容体クラスタリングによって増強される。本研究は、コンドロイチン硫酸（CS）またはデルマタン硫酸（DS）など他のグリコサミノグリカン（GAG）がALKのリガンドであるかどうかを検証することを目的とした。
表面プラズモン共鳴（SPR）分析にて、DSはN末端領域（NTR）のNTRとの有意な相互作用を示したが、他の硫酸化パターンを含むCSフォームは未分化リンパ腫キナーゼ（ALK）に結合しなかった。Western blotting法にてDS二糖（dp2）を除いて、DS四糖（dp4）より長いDSは、ALKの自己リン酸化を用量依存的に誘導し、ALKの活性化を促した。dp4より長いDSはALKの自己リン酸化を濃度依存的に誘導しALKを活性化した。ALKのNTRの重要性にさらに取り組むために、全長ALKとNTRを欠く短縮型ALK（ALKΔNTR）をHEK293T細胞に過剰発現させた。その後、細胞溶解物をビオチン結合DSと混合し、ストレプトアビジンでプルダウンした。ALKΔNTRはDSによってプルダウンされず、全長ALKはDSによって正常にプルダウンされた。これによりDSがALKのNTRの特異的リガンドであることを確認した。2.5μMのDS dp16および天然DSは、全長のALKを活性化したが、一貫してALKΔNTRの活性化を誘導できなかった。DSがALKの新しいリガンドであることが証明された。DSはALKのNTRと直接相互作用し、DS四糖はALKの活性化に十分な誘導能を示した。