2021 Fiscal Year Research-status Report
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21K09300
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
四宮 陸雄 広島大学, 医系科学研究科(医), 寄附講座准教授 (80581454)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
酒井 宏水 奈良県立医科大学, 医学部, 教授 (70318830)
味八木 茂 広島大学, 病院(医), 講師 (10392490)
中佐 智幸 広島大学, 病院(医), 講師 (60467769)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 切断四肢保存 / 自己血灌流 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ラットの切断後肢を用いて人工赤血球灌流による骨格筋保存効果を調べるにあたり，令和３年度は自家血を使用した至適灌流条件の検討を行なった．
ラット下肢の自己血灌流の現在のプロトコールを示す．雄のラットを麻酔下に全採血を行い，アルブミンを付加したPBSを用いてヘマトクリット10%に希釈し灌流液50mlを作製した．同ラットの左下肢を股関節で離断し，大腿動脈にチューブを留置し，ルートを確保した．血液を貯留するリザーバー，ローラーポンプ，酸素化を行う人工肺，下肢を設置したチャンバー，再度リザーバーへ返血できるように回路を設置した．PBSでプライミングを事前に行い，自家血で置換し，灌流を開始した．リザーバーには，ヘパリン，インスリン，炭酸水素ナトリウム，ブドウ糖を持続で投与した．灌流開始をタイム０とし，12時間の灌流を行った．自己血はローラーポンプにより溶血をきたすため，３時間ごとに他の供血ラットを用意して，同種血の50mlの灌流液で置換した．灌流中は30分ごとに血液ガス分析検査を行い，電解質，酸素化などを調べた．12時間時点でインドシアニングリーンを血液に混和し組織造影をおこなって末梢まで灌流が維持できていることを確認した．下肢は灌流前後の重量を計測し浮腫を評価した．腓腹筋内側頭，前脛骨筋を採取し，液体窒素で冷却したイソペンタン酸につけて凍結し，凍結切片を作製した．先行研究の評価方法に従い，体外灌流により起こりうる損傷を評価した．灌流における他の条件として，灌流速度は1ml/min，灌流温度は常温（実験室温度23-25度）とした．
上記条件にいたるまで，条件設定や技術的な面も含めて試行錯誤したが，現在安定した灌流の遂行が可能となった．この条件が人工赤血球灌流による骨格筋保存効果との対照とするモデルである．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
自家血を使用した12時間の灌流が完遂できる割合は現在ほぼ100%に近いが，灌流前後の浮腫の程度のばらつきがかなり大きい．過去の文献から浮腫は(灌流前重量)/(灌流後重量)で+10～30%を予想しているが，+50%をこえることがある．灌流を同条件でおこなっても浮腫の程度が少ない場合と，大きい場合の乖離が大きく，原因がはっきりしない．灌流液の灌流前後の生化学検査（溶血，浸透圧，クレアチンキナーゼ，ミオグロビン）を追加し，原因検索と灌流条件の精度向上を模索している．
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| Strategy for Future Research Activity |
令和4年度の予定では，「ラット骨間筋灌流モデルを作成し自家赤血球と人工赤血球による骨間筋保存効果の比較を行い人工赤血球の有用性を検討する」としているが，現在，ラットの自家赤血球を用いた灌流条件が定まりつつある状態である．前述のとおり少し予定より計画は遅れているが課題解決の上，人工赤血球のモデルとの比較を始めていく予定である．
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