2022 Fiscal Year Research-status Report
ヒトGastruloid(人工擬似胚)を用いたMSCの発生機序解明
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21K09313
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| Research Institution | Kindai University |
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Principal Investigator |
竹原 俊幸 近畿大学, 大学病院, 助教 (60580561)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小野寺 勇太 近畿大学, 大学病院, 助教 (30510911)
寺村 岳士 近畿大学, 大学病院, 准教授 (40460901)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 間葉系幹細胞 / 多能性幹細胞 / Gastruloid |
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| Outline of Annual Research Achievements |
再生医療の移植材料として、間葉系幹細胞(Mesenchymal Stem Cell:MSC)を用いた治療方法の開発が進められている。同時に新たなMSCの供給源として多能性幹細胞からの分化誘導に関する研究が行われているが画期的な方法はいまだになく、普及には至っていない。ヒトMSCの発生機序、詳細な性質と正しい分類、由来組織や時期、培養方法による性質の変化など細胞そのものに対する基本的理解が進んでいないためである。一方で、ヒトの発生解析は、倫理的にも技術的にも実施困難である。本研究では、ヒトNaive型多能性幹細胞を出発点とした試験管内における初期胚発生モデルGastruloidの構築と、これを用いた間葉系幹細胞の発生機序の解明を行う。Gastruloidは三次元的にヒト初期胚発生を模した培養技術であり、現存する発生モデルとしては最もin vivoに近い。本研究では、発生初期がブ ラックボックスに覆われるヒト間葉系原基について、ヒトNaive型多能性幹細胞より誘導したGastruloidを用い、発生機序の解明と新しい分化誘導法の確立を試みる。 令和4年度では、ヒトのモデルとして、まずはマウスGastruloidの新規誘導方法の開発を試みた。再生医療の移植源として考えた場合、大量に細胞を誘導する必要があるが現在のGastruloid誘導法ではコストや手間がかかり、また大量に準備することが困難である。そこで、本年度ではこれらを解決するためにあらたな浮遊系培養システムを構築した。結果、従来法と比べて遜色ない形態、遺伝子発現を示すGastruloidを誘導することが可能であった。これらの結果は将来自動培養システムへの適用も期待できると考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、多能性幹細胞からMSCを誘導すると同時にその発生機序の解明を目的としている。しかしながら、現在のところMSCがどのように発生しているかは詳 細に明らかとなっていない。その理由はMSCの発生過程を観察することができないことが考えられる。そこで、我々はGastruloidと呼ばれる試験管内で三次元的 に初期胚の発生を模した分化を示す誘導方法に着目した。本誘導方法を用いることで体外にて詳細に観察することができ、発生機序の解明が期待できる。 本年度では、マウス多能性幹細胞から従来法とは異なる新たなGastruloidの誘導法の確立を試みた。Gastruloidは通常、96wellや微小なコンポーネント中で個別に培養する必要がある。しかしながら、その場合大量に誘導することが難しく、また効率もあまり良いとは言えない。そこで、浮遊培養システムを基本とし、また細胞塊同士が凝集しないように、高分子ポリマーを用いることで大量に誘導することが可能となった。以上のことから、Gastruloidを簡便に準備することが可能となり、本研究の目的であるMSCの誘導が可能となると考える。研究は予定通り実施しているため、概ね順調に進展していると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和5年度では、これまでに得られたGastruloid誘導法の知見を利用し、まずはマウス多能性幹細胞を用いて、MSCの出現およびその獲得を実施し、その性質の評価を行う。前年度得られたMSC については、成体由来の骨髄間葉系幹細胞との比較を実施し、分化能や増殖能といった性質について本誘導法の優位性があるか評価する。本年度は昨年度までに得られた知見を用いて、移植実験を主体とした実験とヒトへの応用を予定している。そのため、本年度では、マウスES細胞およびヒトiPS細胞を用いたGastruloidへの誘導を実施する。解析には RealtimePCRによる遺伝子発現解析、免疫染色によるMSCの局在やFACSによる MSCへの分化効率を評価することを予定しており、これらの実験に関連した試薬の購入を検討している。また、 MSCの発生を可視化することを考え、抗体およびplasmidの作成・購入を予定している。さらに移植による評価を行うため、実験動物の購入を予定している。
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| Causes of Carryover |
昨年度の計画では主にGastruloid誘導法の開発とその性質を評価することを目的としていたが、予想していたよりも早く研究成果が得られた。そのため、予算を持ち越し次年度における研究計画として、得られた間葉系幹細胞の能力を評価するためマウスへ移植しその生着を観察するための動物実験を実施する予定である。
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Research Products
(2 results)
