2023 Fiscal Year Research-status Report
Comprehensive research on the roles of thyroid function involved in differentiation and proliferation of spermatogonial stem cells
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21K09351
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
林 祐太郎 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 教授 (40238134)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
加藤 大貴 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 研究員 (00620931)
西尾 英紀 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 講師 (10621063)
安井 孝周 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 教授 (40326153)
丸山 哲史 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 教授 (50305546)
水野 健太郎 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 准教授 (70448710)
中根 明宏 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 准教授 (70464568)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 精子幹細胞 / 甲状腺機能 / 精子形成 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
精巣発育不全症候群（Testicular dysgenesis syndrome：TDS）における造精機能障害の原因の一つに、幼若期の精子幹細胞の分化異常が挙げられる。私たちはTDSを対象に、精子幹細胞の分化状態を反映するバイオマーカーを確立すべく基礎研究を進めてきた。精子幹細胞は周囲環境からシグナルを受けて前駆細胞から分化・増殖するとされているが、その全容は明らかでない。本研究では、TDS患児における精巣機能の指標を確立することを目指し、精子幹細胞の分化過程に甲状腺機能がどう関与するか解明することを目的とした。そこで本研究では、研究Ⅰ：精巣の器官培養系を用いたTSH作用機序の解明、研究Ⅱ：幼若精巣に対するT3/T4作用の解析、研究Ⅲ：甲状腺低下/亢進モデル動物における精巣組織の解析、研究Ⅳ：ヒト停留精巣・遊走精巣における甲状腺機能の検討、の4つを立案した。
本年度は、昨年度に引き続き研究Ⅳに関して症例の集積を行った。すなわちヒト停留精巣・遊走精巣について、先天性甲状腺機能低下症を合併した症例だけでなく、合併していない症例をコントロールとすべく臨床情報の集積や精巣組織の解析を進めた。その結果、停留精巣の類縁疾患と考えられていた遊走精巣の精巣組織では精細管あたりのDDX4陽性細胞数が停留精巣に比べ遥かに多いことが判明した。また、研究Ⅲに関して、妊娠母体ラットへのPropylthiouracil (PTU)一過性暴露モデルを作成し、その雄仔の血清ホルモン値をMAGPIXシステムを用いて測定した。その結果、モデル動物では予想通り血清T3, T4の低下、TSH高値を認めた。作成したモデル動物の精巣組織では、精細管径が細小化しており、間質の浮腫状変化を認めた。さらに、DDX4免疫染色により精細胞を詳細に観察したところ未分化な精細胞が増加していることが判明した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初の計画では、研究Ⅰとして精巣の器官培養系を確立し、TSH刺激によりその組織変化を検討する予定であったが、他実験の進行のため、思うように進めることができず達成できていない。また、妊娠母体ラットへのPropylthiouracil (PTU)一過性暴露により、甲状腺機能低下モデル動物の確立を達成できたものの、甲状腺機能亢進モデルの作成・確立までには至ることができなかった。この理由として、PTUの投与濃度設定のため、複数の群を作成する必要があり、また、投与期間についても、1週間と2週間のものを作成し、その後の成長（体重の変化、精巣重量の変化など）についても数週間後までの確認が必要であったため、確立するのに時間を要したことが挙げられる。また、組織解析の手法として、ホルマリンや凍結標本の薄切切片だけでなく、生検体を用いたsingle-cell 解析も当初計画しており、その定量的な評価のため、フローサイトメトリーに取り組む予定であったが、手技的な問題から進展が遅れている。以上のような理由から全体の研究計画はやや遅れていると評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度の研究成果によって、一過性の先天性甲状腺機能低下モデルラットを確立することができた。また、本モデルラットの幼若精巣の組織学的検討も進めているところである。今後は、DDX4以外の精細胞マーカー（GFRa1、UTF1など）による免疫染色も行い、さらなる詳細な評価を行いたい。その他、セルトリ細胞の数や形態の評価、AmhやSox9、Arなどを用いた免疫染色により分化度の評価も進めていきたいと考えている。また、本モデル動物における血清中の甲状腺ホルモン（T3, T4）や甲状腺刺激ホルモン（TSH）などの定量化は行うことができたが、精細胞やセルトリ細胞の挙動に影響するLH, FSH, AMH, INHB, テストステロンなどのホルモン解析を進める必要がある。その他、精巣の器官培養系やsingle cell 解析を進めるために、フローサイトメトリーの実施に際しては、本学内の共同研究センターや実験施設の技術員や研究者ともミーティングを行い、手技的な問題を克服していきたい。
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| Causes of Carryover |
本研究では、精巣発育不全症候群の患児における精巣機能の指標を確立することを目指し、精子幹細胞の分化過程に甲状腺機能がどう関与するか解明することを目的としている。研究計画では実験動物の精巣組織由来の細胞を用いたフローサイトメトリーを行う予定であったが、手技的な問題から進展が遅れている。検体として用いる実験動物や細胞培養液、フローサイトメトリーに使用する試薬などの使用量が計画より少なかったため、次年度使用額が生じた。
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