2021 Fiscal Year Research-status Report
機能改変平滑筋細胞の作製と三次元的な細胞移植による膀胱尿管逆流防止機構強化の試み
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21K09376
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
丸山 哲史 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 教授 (50305546)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
林 祐太郎 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 教授 (40238134)
安井 孝周 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 教授 (40326153)
水野 健太郎 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 准教授 (70448710)
中根 明宏 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 准教授 (70464568)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 膀胱尿管逆流 / 逆流防止術 / 平滑筋細胞 / ホローファイバー / 伸展刺激 / 細胞工学 / 上皮間葉系誘導 / KIT陽性細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
膀胱尿管逆流(VUR)は膀胱から尿管へ尿が逆流する現象である。蓄尿時もしくは排尿時に、尿は膀胱内から尿管(高度な場合は腎盂)へ逆流する。時に有熱性の尿路感染を引き起こし症例によっては慢性腎不全へと進行する先天的疾患で、尿管膀胱移行部(UVJ)にある‘尿管トンネル’の解剖学的な脆弱性が主因とされている。尿管トンネルを延長し補強するさまざまな外科的手技があるが、血尿や排尿痛など侵襲性が高い欠点がある。一方、内視鏡的注入療法は、尿管口から尿管壁にゲル状の素材を注入し尿管トンネルの補強をする手技である。低侵襲であるが成功率が70%と低い。
今回我々は、実際の臨床例を詳細に再検討し、手術困難例における問題点と検討した。尿管の屈曲など解剖学的な異常、そして瘢痕化など組織の変性が成功率を低下させることを明らかにした。このことは、細胞移植による組織機能の改善が必要であることを示唆する。そこで従来のプランに沿って、細胞移植の手技を用いて平滑筋の収縮能および共同性を高めることで尿管蠕動を亢進し、逆流防止機構を増強する手法を試みた。本研究では伸展・電気刺激とサイトカイン刺激により平滑筋細胞間の力学的および電気学的接着を強化する。加えて、間質細胞を分化誘導することで、自己調節能力を有し蠕動運動が可能な細胞群を作製する。今後、これらの機能的細胞群を尿管壁へ注入することで尿流通過性を亢進し、逆流防止機構が増強されることが示唆された。さらに精緻で3D的な注入技術の開発と、幹細胞(ES細胞)から再生した細胞を用いることで生体適合性が担保され臨床応用可能な量の細胞群確保を試みている。開発した細胞群および手技により、膀胱尿管逆流症に加え尿管狭窄症にも臨床応用を試みた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初年度として、力学的強度と方向性を持った平滑筋細胞の培養を試みた。
ホローファイバー（中空糸）システムを用いた細胞培養。私たちはホローファイバーシステムを用いて平滑筋細胞と尿路上皮細胞とを流体下で共培養する手法により、力学的な強度と方向性を持つ尿路組織を作製してきた。ホローファイバーシステムは、中空糸周囲空間（extra capillary space/ ECS）に大量の細胞を培養することを目的に開発された細胞連続培養装置である。中空糸周囲空間（extra capillary space/ ECS）に細胞を培養した。中空糸の外径は200-630μm、膜厚は8-150μmとなる。透析面積は123-2200cm2, ECS 1.4-12mlである。中空糸は高い物質交換特性を持ち、細胞に養分と酸素を供給し、老廃物（アンモニア、乳酸）を除去する。ポンプを用いて培養液を環流させ、自動的に栄養を供給し老廃物を除去した。このシステムを用いて尿路上皮および平滑筋細胞に対して、経時的に細胞数の算定および位相差顕微鏡での形態観察を行った。その増殖能、活性および形態学的特徴を評価し、最適な培養期間および培養の条件等を検討した。
伸展および電気刺激による細胞間接着強度の増加。細胞伸展装置を用いて培養液に一定方向の周期的に強度が変動する電場をかけることで、誘導された平滑筋の配列に規則性があらわれること、および細胞間接着強度が増強し電気的共同性を獲得することを、共焦点レーザー顕微鏡を用いて確認した。流れ刺激により上皮細胞は上皮間葉誘導を来たし平滑筋およびKit陽性間質細胞へと再分化することが示唆された。間葉系細胞のマーカーであるビメンチンの分布を検討した。
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| Strategy for Future Research Activity |
サイトカイン刺激によるKit陽性間質細胞の誘導。培養した平滑筋細胞に対してKitリガンドであるStem Cell Factor (SCF)を加えることで、Kit陽性間質細胞をこのシステム内に誘導する。平滑筋細胞層が組織全体としても統一性ある運動（いわゆる蠕動運動）をすることを電気生理学的および薬理学的に確認する。さらに、KitリガンドであるStem Cell Factor (SCF)を加えることでKit陽性間質細胞をこのシステム内に誘導する。
精緻で3D的な注入による方向性と共同的性を持つ平滑筋細胞層の作成。尿管口を切開することでVURを作成したVURラットモデル用いて、尿移送が効率的であることを確認する。注入の際には電気刺激を併用することで方向性を保つことが確認する。Kit陽性間質細胞を追加注入することで共同性が獲得されることを確認する。
ES細胞への刺激因子付加による平滑筋細胞系確立の試み。ES細胞をレチノイン酸または成長因子(SHHおよびDKK1)を付加した条件で培養する。液中でhanging drop法を用いembryoid body（胚様体：EB）を形成させ分化させる。5日後にEBを再度ディッシュに付着させて分化を進め、時間の経過とともに平滑筋細胞のマーカーであるミオシン重鎖(SM1,SM2)を発現した細胞群を回収する。これら細胞群を3D培養し、αアクチン、カルデスモンの発現およびdense bodyの形成など平滑筋細胞としての形態的特徴を評価する。
以上を施行するために、重層的な研究体制を構成することで組織の安定化を図る。ホローファイバーシステム作製、マトリックス作製、動物実験（ラット）・細胞培養・遺伝子発現解析などそれぞれの技術に習熟した研究者の協力のもとに実験を遂行する。効率的に研究を進めるため研究方法ごとに研究者を分担する。
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| Causes of Carryover |
膀胱尿管逆流症に対する治療法の開発のための基礎研究である。伸展・電気刺激とサイトカイン刺激により平滑筋細胞間の力学的および電気学的接着を強化する。加えて、間質細胞を分化誘導することで、自己調節能力を有し蠕動運動が可能な細胞群を作製する。これらの機能的細胞群を尿管壁へ注入することで尿流通過性を亢進し、逆流防止機構の増強を目指す。計画自体は順調な滑り出しであったがCOVID-19による通常の医療業務が大幅に変更となり、予定してていた研究を進めることができなかった。また国際・国内学会出張も計画していたが、出張することもできなかった。このため次年度使用が生じた。 １)力学的強度と方向性を持った平滑筋細胞の培養 2) ２）精緻で3D的な注入による方向性と共同的性を持つ平滑筋細胞層の作成を加速させたい。
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Research Products
(4 results)
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[Journal Article] Low Serum Inhibin B/Follicle-Stimulating Hormones and Anti-Mullerian Hormone/Follicle-Stimulating Hormones Ratios as Markers of Decreased Germ Cells in Infants with Bilateral Cryptorchidism2021
Author(s)
Kato T, Mizuno K, Matsumoto D, Nishio H, Nakane A, Kurokawa S, Kamisawa H, Maruyama T, Iwatsuki S, Umemoto Y, Yasui T, Hayashi Y
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Journal Title
J Urology
Volume: 207
Pages: 701-709
DOI
Peer Reviewed
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[Presentation] Low Serum Inhibin B/Follicle Stimulating Hormone and Anti-Mullerian Hormone/Follicle Stimulating Hormone Ratios2021
Author(s)
Kato T, Mizuno K, Nishio H, Nakane A, Kurokawa Sa, Kamisawa H, Maruyama T, Iwatsuki S, Umemoto Y, Yasui T, Hayashi Y
Organizer
American Urological Association Annual Meeting
Int'l Joint Research
