2021 Fiscal Year Research-status Report

電子顕微鏡によるラット嗅球vasopressin免疫陽性ニューロンの神経回路解析

Research Project

Project/Area Number	21K09594
Research Institution	Kawasaki Medical School
Principal Investigator	野津英司川崎医科大学, 医学部, 助教 (80388933)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Keywords	嗅球 / 電子顕微鏡 / vasopressin / synapse
Outline of Annual Research Achievements	嗅球は嗅粘膜で感知された嗅覚情報を受け取る領域で、種々の介在ニューロンと主要な投射ニューロンである mitral cell および tufted cell の間に種々の神経回路が形成され、嗅覚情報の処理を行っている。本研究では嗅球に分布し、形態的な特徴からtufted cellであると報告されているvasopressin neruronが形成している神経回路の解析を行い、その興奮を調節する入出力を形態学的に明らかにすることを目的としている。嗅球vasopressin neuronはマウスおよびラットの実験から同種の固体の識別・認識などに関連していると考えられている。 vasopressin neuronは免疫染色によって標識し、その形態を光学顕微鏡および電子顕微鏡レベルで解析を進めている。これまでに行った光学顕微鏡レベルでの観察から、嗅球vasopressin neuronは、鼻腔嗅粘膜からの匂い情報が投射される嗅球糸球体内でvaricosity構造を形成していることが確認できた。この形態的な特徴から糸球体内でのvasopressinの放出をしていることが示唆される。また、vasopressin neuronのdendritesは、VGluT2によって標識された嗅神経の近傍にも分布しており、嗅神経との接触が期待出来る結果が得られている。vasopressin neuronと嗅球の介在ニューロンとの接触について光学顕微鏡での解析を進め、抑制性の入力を形成するニューロンの検討を進めている。一方で、電子顕微鏡での解析については、免疫染色での十分な染色像が得られておらず、電子顕微鏡観察で必要なglutaraldehydeを含有した固定処理によって嗅球切片の抗原性および抗体浸透性の低下が生じていることが考えられる。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 本研究では嗅球に存在するvasopressin neuronが形成する神経回路について、形態学的な手法での解析を行っており、vasopressin neuronは免疫染色の手法で標識し、光学顕微鏡および電子顕微鏡での観察を行っている。免疫染色によるvasopressin neuronの標識は非常に弱く、通常の染色法では確認することが非常に困難であり、増感処理を行うことで十分な染色結果を得ることができた。この結果は嗅球vasopressin neuronが含有するvasopressinの量が著しく少ないことを示唆しており、十分な染色像を得るまでに様々な手法を検討したために進捗が遅れている。また、電子顕微鏡での解析については研究実績の概要で示したように、電子顕微鏡観察では固定条件および染色条件について更なる検討が必要となっている。
Strategy for Future Research Activity	光学顕微鏡レベルでの嗅球に存在する機知のマーカーによって標識される細胞群との関係の解析を進める。具体的にはシナプス前終末におけるglutamate放出に関わるvesicular transporterの有無や糸球体層に位置する傍糸球体細胞との関連についての解析をおこなう。また、シナプスの観察に必須となる電子顕微鏡の観察については、固定条件および染色条件を決定し、電子顕微鏡標本の作製を進める。
Causes of Carryover	当初予定していた免疫電顕法によるvasopressin neuronの解析において、技術的な問題から電子顕微鏡標本の作製に時間がかかっており、予定していた標本作製試薬および、他のニューロンを標識するマーカーに対する抗体等の購入が遅れており、次年度使用額が生じている。今後条件検討を進める際の抗体および固定液、増感試薬などの購入およびその後の標本作製等に使用する電子顕微鏡用樹脂、グリッドなどの消耗品の購入に使用する予定である。