電子顕微鏡によるラット嗅球vasopressin免疫陽性ニューロンの神経回路解析

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K09594
• Research Institution: Kawasaki Medical School
• Principal Investigator: 野津 英司 川崎医科大学, 医学部, 助教 (80388933)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: 嗅球 / 電子顕微鏡 / vasopressin

Outline of Annual Research Achievements

本研究では免疫染色で標識したvasopressin neuronを電子顕微鏡で観察することで嗅球での神経間の接続を解析するものである。そのため、免疫染色と電子顕微鏡観察の二種類の手法でのvasopressin neuronの形態を解析する必要がある。免疫染色では、嗅球vaopressin neuronの染色条件の検討を進め、抗体によるvasopressin neuronの標識に加え、チラミドを用いた増感法を用いることで、糸球体に伸びる樹状突起を可視化することが可能となり、他の嗅球ニューロンとの多重染色を進めている。
先行研究から、vasopressin neuronが嗅球内で抑制性の入力を受けていることが考えられることから、嗅球での抑制性の介在ニューロンとの接触について解析を進めている。具体的には、嗅球糸球体周囲に存在する主要な介在ニューロン群である房糸球体細胞のマーカを用いて染色を行った。そのなかで、房糸球体細胞の中で多数を占める主要なサブポピュレーションであるカルレチニン免疫陽性細胞をその候補としてシナプスの解析を行った。その結果、カルレチニン免疫陽性細胞が形成する明瞭なシナプスは確認できず、vasopressin neuronへの抑制性の入力を行う候補としての可能性は低いことが示された。一方で、電子顕微鏡でのvasopressin neuronの解析は、免疫染色の条件と電子顕微鏡標本の作製を両立する条件の設定が難しく、これまで進んでいなかったが、条件の検討を進めた結果、通常の電子顕微鏡観察で用いるグルタルアルデヒドを用いない条件で免疫染色と完全ではないが電子顕微鏡での観察の両方を行うことが可能となった。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

当初計画していた免疫染色でのvasopressin neuronの標識について予定通りに進まず、条件の検討に時間がかかっている。主な問題点としては、免疫染色でのvasopressin neuron細胞の細胞体の染色強度が特に低く、嗅球内のvasopressin neuronの線維が嗅球に存在するものに由来するのか、他の領域から投射されたものかの判別が困難であり、研究に遅れが生じている。また、免疫染色と電子顕微鏡観察を同一の標本で行う必要があるため、免疫染色での低い染色性と、特に強い固定法を必要とする電子顕微鏡観察条件の調整に時間がかかったために遅れが生じている。

Strategy for Future Research Activity

これまでに検討した染色条件での実験を進め、当初主要な目的としていた嗅神経からvasopressin neuronへの入力の有無について電子顕微鏡での解析を進める。

Causes of Carryover

予算の使用計画は抗体など消耗品を主な使用目的としており、現在までの進捗状況に記載した理由から研究が遅れており、予定より消耗品の使用量が増えなかったことから次年度使用額が生じた。今後の使用予定としては従来の予定通り抗体など試薬、電子顕微鏡関連経費などに使用する計画である。