CCT2複合ヘテロ変異による網膜変性モデルマウスの病態と網羅的タンパク質定量解析

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K09689
• Research Institution: 独立行政法人国立病院機構(東京医療センター臨床研究センター)
• Principal Investigator: 岡本 晶子 (須賀) 独立行政法人国立病院機構(東京医療センター臨床研究センター), 分子細胞生物学研究部, 研究員 (70450400)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 峯岸 ゆり子 公益財団法人がん研究会, がんプレシジョン医療研究センター プロテオミクス解析グループ, 研究員 (20621832)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: 遺伝性網膜疾患 / レーベル黒内障 / ゲノム編集 / 疾患モデルマウス / 病態解析 / シャペロニン / 視細胞

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、小児期から重度の視力障害を示すレーベル黒内障（LCA）の原因となるシャペロン分子の変異を持つモデルマウスを作成し、病態解析と発症機序の解明を目指すものである。我々の研究室では潜性遺伝を示すレーベル黒内障患者からCCT2の複合ヘテロ変異を同定した。CCT2分子を含むTRiC/CCTシャペロニン（CCT）は真核生物で保存された分子シャペロンであり、細胞骨格因子や網膜のGタンパク質同定の折り畳みを介助する。我々はLCA患者で見られた進行性の網膜変性の発生機序解明のために、CCT2複合ヘテロ変異のそれぞれのアミノ酸置換（T400P、R516H）を持つノックインマウスラインを作成し、掛け合わせによりT400P/R516Hコンパウンドヘテロマウス、R516Hホモマウスを得た。T400Pホモは胎生致死、T400P/R16H は生後2週齢で致死、R516Hホモは生後4週齢から10週齢にかけて視細胞変性が進行することを確認した。R516H 変異がシャペロニン機能に影響するかどうか、また視細胞変性の初期に影響を受けるタンパク質を明らかにするために、４週齢R516Hホモマウスと野生型マウスの網膜を採取しラベルフリー定量プロテオーム解析を行った。同定された8780種類のタンパク質のうち１０８種類はR516Hホモマウス網膜で有意に発現量が低下していた。ここには既知のCCT基質である光伝達物質、BBSタンパク群、WDRタンパク群が含まれており、R516H変異は生体網膜内でCCTのシャペロニン機能を低下させることが示された。これに加えて網膜での発現が知られていなかった視細胞の一次繊毛に局在するタンパク質を同定し、R516Hホモマウスでは局在が変化することを示した。これらの結果からレーベル黒内障の原因変異はCCTのシャペロニン機能を低下させ、特に視細胞の繊毛構造の維持に影響すると考えられた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

令和５年度前半は論文投稿に向けてデータを整理した。現在査読コメントに対応した修正と実験の追加を行っている。また本研究成果から派生した研究として、新たに視細胞繊毛に局在することが分かったタンパク質について、繊毛の形成・維持に対してどのような働きをしているのかをin vitroの過剰発現実験、ノックダウン実験で検証している。

Strategy for Future Research Activity

現在査読修正中の論文を受理・公開までもっていく。視細胞繊毛に局在するタンパク質については、遺伝性網膜疾患患者の原因遺伝子探索において本遺伝子のバリアントを含めて確認する。本研究で作成したゲノム編集マウスはバイオリソースとして論文公開後に寄託を予定している。

Causes of Carryover

in vitro実験に必要なプラスチック器具は研究室のストックを利用できたため科研費からの支出が抑えられた。投稿論文の修正が年度末にかかったため、受理された場合のAPC支払いを見込んで科研費の一部を次年度使用にした。

Research Products

• [Journal Article] A homozygous structural variant of RPGRIP1 is frequently associated with achromatopsia in Japanese patients with IRD (2024)
  • Author(s): Akiko Suga, Kei Mizobuchi, Taiga Inooka, Kazutoshi Yoshitake, Naoko Minematsu, Kazushige Tsunoda, Kazuki Kuniyoshi, Yosuke Kawai, Yosuke Omae, Katsushi Tokunaga, Takaaki Hayashi, Shinji Ueno, Takeshi Iwata
  • Journal Title: Genetics in Medicine Open Volume: - Pages: 101843～101843
  • DOI: 10.1016/j.gimo.2024.101843
  • Peer Reviewed / Open Access