2022 Fiscal Year Research-status Report
緑内障術後創傷治癒におけるエピゲノム変化とメモリー効果に関する研究
| Project/Area Number |
21K09703
|
|---|
| Research Institution | Kumamoto University |
|---|
Principal Investigator |
井上 俊洋 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 教授 (00317025)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
井上 みゆき 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 医学教育部研究員 (20631766)
藤本 智和 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 助教 (50756426)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
|
| Keywords | 緑内障 / 創傷治癒 / エピゲノム |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
マイトマイシンCを併用しないウサギ濾過手術モデルと併用したin vivoモデルで遺伝子発現を網羅的に比較する目的でRNAシークエンスを行った。術後3時間のデータでは、17014遺伝子のうち、発現変化に有意差のあった遺伝子は2834個であった。このうちエピゲノム因子では、KDM4C、HDAC5、HDAC6、HDAC8、HDAC11、SMYD3、SIRT5、DNMT1、DNMT3Aの発現低下をみとめた。一方、培養結膜線維芽細胞にマイトマイシンC処理の有無で同様に比較したin vitroモデルでは、3時間後のデータでKDM4B、KDM4C、KMT2C、HDAC3の有意な低下をみとめた。以上から、共通する因子としてKDM4Cを同定し、その基質の一つであるトリメチル化H3K9をターゲットとして解析を進めた。下流因子の候補を検索するために、結膜線維芽細胞を用いたin vitroモデルで、マイトマイシンC処理3日後のRNAシークエンスを行った。この結果に対してKEGGパスウェイ解析を行ったところ、DNA replicationとCell CycleがTop2であった。3日後に変動していたCell Cycleの遺伝子のうち、c-Myc、CCNA1、CCNA2のプロモーター領域にプライマーを設定し、抗メチル化H3K9抗体を用いてChIP-qPCRを行ったところ、マイトマイシンC処理後にシグナルが上昇する傾向を認めた。以上の結果から、マイトマイシンC処理によって、結膜線維芽細胞において細胞周期を正に制御する遺伝子のプロモーター領域においてH3K9のメチル化が亢進し、結果としてその遺伝子発現が低下していることが示唆された。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ウサギを用いた濾過手術のin vivo動物モデルにおいて、RNAシークエンスデータ解析を行うとともに、培養結膜細胞を用いたin vitroモデルでも同様にRNAシークエンスデータを取得し、ターゲット分子を絞り込むことができた。さらに、マイトマイシンCの有無による網羅的遺伝子発現の比較解析を行った結果、in vivoモデルとin vitroモデルで共通したエピゲノム因子としてKDM4Cを同定し、下流の因子としてChIP-qPCRを用いて細胞周期関連遺伝子の解析に着手できた。よって、2年目として、順調に進行していると考える。
|
| Strategy for Future Research Activity |
in vivoモデルとin vitroモデルで共通したエピゲノム因子であるKDM4Cについての解析を進める。KDM4Cの基質である抗トリメチルH3K9抗体を用いたChIP-qPCRにおいて、未解析であるCCNB1, CCNE1, CCNF, CDK1, CDK2のプロモーター領域の変化を解析する。また、抗KDM4C抗体を用いたChIP-qPCRも試みる。さらに、siRNAや阻害剤（QC6352など）を用いてKDM4Cを阻害し、下流遺伝子発現、細胞増殖に変化があるか検証する。また、濾過手術の動物モデルにおいて、シングルセルRNAシークエンス解析を行い、各種細胞における遺伝子発現の変動を調べ、臨床においてメモリー効果を担う細胞を線維芽細胞以外も対象に検討し、ファイブロサイトを含めた創傷治癒への関与について、次のステップの検証に繋げる。
|
| Causes of Carryover |
試薬の値段が見込みより安かったため85,945円の差額となった。この額を見込んで計画的に使用する予定である。
|
