加齢黄斑変性における「網膜色素上皮-ブルッフ膜」メンテナンスの解明

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K09705
• Research Institution: Nagoya City University
• Principal Investigator: 加藤 亜紀 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 講師 (60405157)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 安川 力 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 教授 (00324632)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 網膜色素上皮スフェロイド / 網膜色素上皮密度

Outline of Annual Research Achievements

2021年度は、in vitroにおいて、網膜色素上皮(RPE)スフェロイドの作成を行った。
従来使用していた、ドイツアイバンクからの細胞提供、企業からのprimary　RPEの購入ができなかったため、種々の細胞を試した。ヒトテロメア逆転写酵素（hTERT; Human Telomerase Reverse Transcriptase）遺伝子を初代培養細胞に導入して作製したRPEを培養、各種染色、スフェロイド作成を行ったところ、従来のRPE細胞で作成したものと同じスフェロイドの作成が可能であったため、hTERT-RPEを本研究に用いることにした。RPEの通常の培養過程、およびスフェロイド生成過程のタイムラプス撮影を行った。タイムラプス撮影において、RPEは早期から、凝集し始め１時間程度で塊となり、12時間後には凝集し、その後ゆっくりサイズが小さくなることを発見した。
同時にコラーゲンやエラスチンの免疫染色も行い、各種たんぱく質の発現が従来のRPEと同じように発言していることを確認した。

In vivoにおいては、ヒト高齢者の眼球組織において、眼球の各部位（黄斑部、耳側、鼻側）に分割して網脈絡膜のフラットマウントを作成した。ZO-1で免疫染色を行い、細胞の境界を可視化した。細胞は報告されているように6角形をしていた。得られた標本から、細胞密度、および細胞面積のばらつきを評価する方法を検討した。画像の二値化とボロノイ法の数式を用いてRPEの密度および大きさのむらを数値化することに成功した。フラットマウント標本の評価を行ったところ、黄斑部の細胞密度は周辺部より小さく、ムラも少ない傾向があることを発見した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

In vitroにおいては従来使用していた、ドイツアイバンクからのRPE細胞提供がなく、また企業から購入していた輸入のprimary　RPEの入手もできなくなったため、別のRPEを探す必要があった。3倍体や4倍体のいわゆるcell line cellはプライマリーcellと異なりスフェロイドやシートを形成しないため、他の細胞を試す必要があった。

In vivoにおいては、長寿医学研究所/神経病理研究所に保存されている固定標本は、脳実質などと同じ条件で固定されており、賦活化しても、免疫染色が困難で、限られたサンプルを有効に使用するため、少しずつ種々の条件をためす必要があった。

Strategy for Future Research Activity

In vitroにおいて、加齢黄斑変性の原因とされている酸化ストレス（ニコチン、Cocl2、H2O2）あるいは光線暴露などの負荷を与えた状態でスフェロイドおよびシートの形態変化を評価する。
またGタンパクおよびブルッフ膜構成成分の発現を評価する。さらにリポタンパク排泄やドルーゼン形成生理機能を検討する。

In vivoにおいては提供されたヒト網脈絡組織にドルーゼンや異常血管などの異常病変がないかをさぐる。
異常病変があるサンプルとないサンプルで、種々のたんぱく質の免疫染色を行い、相違を検討する。さらに、診療録から、全身疾患や血液検査の結果を抽出し関連性を評価する。

Causes of Carryover

in vitroにおいて、適正な細胞を探すのに時間がかかり、免疫染色など次の過程に必要な試薬の購入を見合わせたため。