加齢黄斑変性における「網膜色素上皮-ブルッフ膜」メンテナンスの解明

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K09705
• Research Institution: Nagoya City University
• Principal Investigator: 加藤 亜紀 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 講師 (60405157)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 安川 力 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 教授 (00324632)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: ドルーゼン / 網膜色素上皮

Outline of Annual Research Achievements

In　vitroにおいては2022年度に引き続いて、ドイツアイバンクからの細胞提供、企業からのprimary　RPEの購入ができなかったため、ヒトテロメア逆転写酵素（hTERT; Human Telomerase Reverse Transcriptase）遺伝子を初代培養細胞に導入して作製したRPE使用して、スフェロイド作成、研究を継続した。
免疫染色においてはアミロイド前駆タンパクやアミロイドの染色を中心に施行した。またタイムラプス撮影において、詳細に撮影する時間を限定し、より細かく撮影することで、リポタンパク排出の瞬間やドルーゼン発生の瞬間撮影をこころみた。
In vivoにおいては、長寿医学研究所/神経病理研究所に保存されている高齢者の眼球固定標本の免疫染色を断念し、凍結標本に集中して研究を継続した。保存状態が悪いものに関しては、まずはウエスタンブロットでたんぱく質の有無の評価するに切り替え、年齢や、既往歴、網脈絡膜の位置によってことなるかなどを検討し、今後の研究につなげることにした。
RPEスフェロイドとともにRPEシートの作製を行った。入手できたhTERT-RPEでもRPE単層シートの作製は可能であった。タイムラプス撮影も試みた。しかし、単層シートのタイムラプスはフォーカスを合わせるのが難しく、条件設定などを検討中である。並行してRPEシートの免疫染色をおこない、primary RPE と同様にタイトジャンクションやアミドイロ関連タンパクの染色が可能であることを確認した。ドルーゼンを確認できるか検討したが顕微鏡的に同定するのは困難で、今後の課題とした。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

RPEシートのタイムラプス撮影が予想以上に困難であった。
凍結標本の染色が困難で、阻止委のたんぱく定量に切り替えた。

Strategy for Future Research Activity

引き続き、RPEスフェロイドとともにRPEシートのタイムラプス撮影も行う。
In vitroにおいて、加齢黄斑変性の原因とされている酸化ストレス（ニコチン、Cocl2、H2O2）あるいは光線暴露などの負荷を与えた状態でスフェロイドおよびシートの形態変化を評価する。またGタンパクおよびブルッフ膜構成成分の発現を評価する。さらにリポタンパク排泄やドルーゼン形成生理機能を検討する。
提供されたヒト網脈絡組織にたんぱく質を抽出する。異常病変があるサンプルとないサンプルで、相違を検討する。さらに、診療録から、全身疾患や血液検査の結果を抽出し関連性を評価する。

Causes of Carryover

追加試薬の購入、細胞培養や染色にかかる人件費、発表のための旅費などに使用予定である。