分泌されたEYSが網膜色素上皮細胞の貪食能にあたえる影響の解析

2023 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 21K09710
• Research Institution: The University of Tokushima
• Principal Investigator: 梶田 敬介 徳島大学, 病院, 医員 (10896765)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 大西 暁士 立命館大学, 総合科学技術研究機構, 教授 (70569102) ; 前田 亜希子 立命館大学, 総合科学技術研究機構, 教授 (40776423)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 網膜色素変性 / EYS / 網膜色素上皮

Outline of Annual Research Achievements

EYS(eyes shut homolog)は日本人における網膜色素変性(RP)の約3割を占める重要な原因遺伝子だが、その機能に関する研究は驚くほど少なくRP病態におけるEYSの役割は明らかではない。本研究では「分泌されたEYSはRPEに発現するPROM1と相互作用することで、RPEの貪食能を制御しているのではないか」という仮説を立て、これを実証することを目的としている。上記の仮説を実証するため、以下の２つの課題を実施している。
「課題１．光刺激時におけるEYSとPROM1の局在解析」明順応・暗順応させたゼブラフィッシュの眼組織およびブタ網膜組織の切片を作成し、抗EYS抗体と抗PROM1抗体を用いて免疫組織染色を行う。暗順応時のゼブラフィッシュとブタ網膜切片を作成し、抗EYS抗体をもちいて免疫染色を行いEYS発現を確認した。ゼブラフィッシュでは抗EYS抗体、抗PROM１抗体がワークしなかった。ブタではEYSは視細胞外に分泌されていたが、飼育の関係上光刺激による局在変化の観察は困難だった。
「課題２．EYS存在下でのRPE貪食能変化の検討」RPE細胞を分泌EYSと共培養し、貪食能を評価する。これにより、培養液中に分泌されたEYSがRPEの貪食能に与える影響を明らかにする。 FLAGペプチドが融合したEYSを発現するプラスミドを作成し、HEK293T細胞にトランスフェクションした。細胞内と培養液中にFLAGペプチドが融合したEYSが発現していることを確認し、培養液中のFLAGペプチドが融合したEYSを回収し濃縮することができた。貪食能の評価については、蛍光ラベルしたブタ網膜外節（POS)を独自に作成した。上記で作成したFLAG-EYSの存在下でPOSをRPEに貪食させ、RPEの貪食能を評価した。その結果、培養液中にEYSが存在した場合、RPEの貪食能が低下することがわかった。