眼感染症病巣のRNAシークエンス網羅解析による病態解明

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K09720
• Research Institution: Tottori University
• Principal Investigator: 井上 幸次 鳥取大学, 医学部, プロジェクト研究員 (10213183)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 宮崎 大 鳥取大学, 医学部, 教授 (30346358) ; 春木 智子 鳥取大学, 医学部附属病院, 助教 (90838153)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 感染性角膜炎 / 角膜潰瘍

Outline of Annual Research Achievements

当研究では、感染性角膜炎及び感染性眼内炎の微生物同定を目的として、試料を集積している。また、病態の把握を目的として、定量病原体PCRによる知見の集積を進めている。さらに、生体の防御因子として早期に発動可能な自然免疫系と、獲得免疫系の因子群の病態への寄与も検証している。特に、角膜感染症の局所からえられる情報は、mRNAも含めその翻訳タンパクがあり、それらの産生及び制御への包括的な理解が必要となる。中でも、炎症性サイトカインは、ホストの抵抗性を制御する上で重要な因子であり、これらの解析も必要となる。
まず、単純ヘルペス感染症において、難治性実質型角膜ヘルペス患者を対象に解析を進め、病変の再燃における自然免疫系と獲得免疫系の寄与を包括的に検証している。前眼部サイトメガロウイルス感染においては、細胞障害性Tリンパ球反応が再発抑制のみならず角膜内皮損傷に関与することを明らかにしてきた。
さらに、miRNAを含むRNAは一般的に不安定であるが、RNAは、エクソソーム内においては安定的に存在する。そこであわせてエクソソーム内のRNAの解析をすすめている。特に、エクソソームは、細胞間コミュニケーションの手段としても使われるため、まず、涙液エクソソーム内における内因性RNA種のプロフィールを調べ、開発を進めている。
以上の研究を通じて、感染性角膜炎及び感染性眼内炎の病態に関する知見を深め、治療法の改善に貢献したいと考えている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

新規に受診した感染性角膜炎及び感染性眼内炎において微生物同定のためのDNA試料を集積しつつある。あわせて病巣からのRNA試料も集積しつつある。
RNA sequencing解析を含めた包括的RNA解析のためには、活動性や病態、採取時期を検証したうえで代表的な試料を抽出したうえでとりかかる必要がある。このために、試料収集とあわせて病態機能面の解析を平行してすすめつつある。RNA sequencing解析による妥当性を担保するため、タンパクレベルの解析に加え、ホストの免疫制御機構の解析を臨床検体を用いてすすめつつある。例えば、単純ヘルペス性角膜炎においては、ウイルス増殖と抗ウイルス免疫反応の病像が引き起こされる。この場合、治療の中断によりウイルス再活性化や再燃をおこしやすくなるが、まず、こうした現象に関連するホスト要因や環境因子の同定を図り、RNA profileに大きく影響しえる因子のプロテオーム解析を行い、候補因子を同定した。また、サイトメガロウイルスによる二次性緑内障や角膜内皮炎に関しても、病態や予後に寄与する因子の解析をすすめている。その結果、特にホストの細胞障害性リンパ球反応の有用性がうかびあがってきた。また、RNAは一般に細胞外ではきわめて不安定であるが、細胞から放出されるエクソソーム内においては安定的に保護される。このため、RNAの抽出ソースとしてエクソソームの有用性の検証をすすめ、涙液エクソソームにおける内因性RNA種プロフィールを明らかにした。以上、検証すべきRNA種は的をしぼった上で解析をすすめていく必要があり、臨床病態の詳細な解析に加え、機能面でのしぼりこみをすすめつつある。

Strategy for Future Research Activity

本研究は、最終的には、簡便な試料採取を用いて簡便に病態の診断が可能な検査システムの構築を目指している。このためには、試料の安定性、採取の容易さ、さらには情報量の多さなどさまざまな要素を勘案する必要がある。たとえば、RNA種は、涙液あるいは前房水から抽出可能であるが、通常の場合、安定性に問題がある。安定性を考えた場合、細胞から放出されるエクソソームは、RNAを安定的に含有する。このため、涙液エクソソームは、疾患の特異的マーカーとして使える可能性が高い。さらに、検査システムの構築の容易さおよび検査の即時性を考慮した場合、エクソソームの表面マーカー群も疾患種の同定に有用である。このため、質量分析を用いたエクソソームマーカー探索が可能か、手法の確立をすすめている。
包括的RNA種プロフィールは、病態理解を容易とする。一方、将来の応用面を考えると、エクソソーム表面マーカーも重要であると考えている。表面マーカーが同定できた場合、RNAと異なり、臨床現場において短時間で結果をえることができる。このため、表面マーカー種の探索手法の確立を併用してすすめることが必要であると考えている。
さらに、病態マーカーの探索のためには、ホスト因子や環境因子の関与まで理解する必要がある。このため、環境因子のデータベースを用いた検証もすすめている。

Causes of Carryover

今年度の残が少額であったため、有効に物品を購入するため次年度に繰り越した。