網膜視細胞におけるトポイソメラーゼIIβの生理、病理学的役割の検証

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K09721
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 細谷 修 岡山大学, 医歯薬学域, 助教 (90304310)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: トポイソメラーゼIIβ / 網膜 / 視細胞 / メダカ / Tet-ON / CRISPR/Cas9 / Cre/loxP / 網膜疾患

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は、小型硬骨魚類メダカの桿体視細胞（桿体）を解析モデルに、成熟期以降の視細胞および網膜視機能におけるトポイソメラーゼIIβ（TopoIIβ）が果たす役割を明らかにし、網膜変性疾患の発症やその病態への関与の可能性を検証することである。令和３年度は終末分化後の任意のタイミングで（成熟期、老齢期）桿体限定的に TopoIIβ遺伝子の機能阻害を起こすトランスジェニックメダカ系統の作出を行った。初めに抗生物質テトラサイクリン系のドキシサイクリン（Dox）を添加・除去することでメダカ桿体特異的に任意のタイミングで導入遺伝子の発現をON/OFF制御できる新規テトラサイクリン遺伝子発現調節システム（newTet-ON）を開発した（論文、学会で発表）。続いて、newTet-ONシステムとCRISPR/Cas9 nuclease（Cas9）システムを用いてトランスジェニックメダカ２系統：Tg(U6-TopoIIβ-gRNA) (RNA pol III系プロモーター制御下に全身性にゲノム上のTopoIIβ遺伝子の特定DNA配列を標的とするガイドRNAを発現する系統) とTg(Rho-Cas9) (ロドプシンプロモーター(Rho)制御下で薬剤添加時に桿体特異的にCas9を発現する系統) の作出後、これら2系統の交配によりTopoIIβ遺伝子の機能解析の為のコンディショナルノックアウト系統 Tg(U6-TopoIIβ-gRNA; Rho-Cas9) を作出した。令和４年度は、時期・細胞種特異的なTopoIIβ遺伝子の完全破壊を達成するために、newTet-ONシステムとCre recombinase (Cre)/loxP部位特異的DNA組換えシステムを併用した新たなコンディショナルノックアウトメダカ系統（TopoIIβflox/flox; Tg.Rho-Cre）の追加作出を実施した。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

TopoIIβの機能解析のためのトランスジェニックメダカの作出に必須で基盤技術となる遺伝子発現調節システム（newTet-ON）の新規開発に成功したことでメダカ桿体視細胞特異的に任意のタイミングで任意の導入遺伝子の発現誘導を制御することが可能となった。そこで、開発したnewTet-ONシステムとCRISPR/Cas9システムを併用し、コンディショナル TopoIIβ遺伝子ノックアウトメダカ系統 Tg(U6-TopoIIβ-gRNA; Rho-Cas9) の作出を行った。この段階までは当初の予定通りに研究を進めることが出来た。しかし、成熟期および老齢期の Tg(U6-TopoIIβ-gRNA; Rho-Cas9) 系統を用いて桿体において TopoIIβ遺伝子の改変誘導を試みたところ、期待に反して標的塩基配列部位への挿入・欠失（indel）形成効率が低く、TopoIIβ遺伝子の発現あるいは機能を十分に抑制することが出来ないことが判明した。そのため当初の計画を変更し、新たな解析モデルの作出を急遽追加することにした。現在、Cre/loxPシステムを利用して、TopoIIβ遺伝子の目的配列部位で高効率に両アリル破壊が誘起できる新たなコンディショナルノックアウトメダカ系統 (TopoIIβflox/flox; Tg.Rho-Cre) の作出を進めているところである。問題がなければ今夏までには作出が完了する予定である。上記の理由から、当初令和３年度後期から令和４年度前期頃に開始を予定していた TopoIIβ遺伝子ノックアウト後の桿体および網膜細胞の表現型解析は、令和５年度に先送りせざるを得ない状況が発生した。

Strategy for Future Research Activity

新規コンディショナルノックアウトメダカ系統（TopoIIβflox/flox; Tg.Rho-Cre）の作出を最短で進めるために、複数の実験工程を同時進行できるように綿密に実験計画を組み直した。新計画に従って、これまでに loxP 配列挿入用の長鎖一本鎖DNAドナー配列合成、ゲノム編集技術を用いたノックイン用のガイドRNA作製、受精卵へのマイクロインジェクション、トランスジェニックファウンダー（TopoIIβ flox/+ メダカ）の選抜、F２世代の TopoIIβflox/+ メダカ同士の交配による biallelic floxed メダカ系統（Topo IIβ flox/flox）の作出までを問題なく終えることが出来た。また合わせて、Creをコンディショナルに発現させる為の遺伝子改変用のトランスジーンベクター（Rhoプロモーター制御下で Dox処理で桿体特異的に Creを発現）の作製とトランスジーンベクターの動作確認 (Dox処理によるメダカ桿体特異的な Creの発現誘導)、 TopoIIβ flox/flox メダカ由来の受精卵へのトランスジーンベクターのマイクロインジェクションも終えることが出来た。現在、目的のトランスジーン配列をもつ TopoIIβflox/flox メダカの選抜の段階にあり、今夏には新系統（TopoIIβflox/flox; Tg.Rho-Cre）の作出が完了する予定である。作出完了後は、速やかに成熟期以降の視細胞および網膜視機能における TopoIIβが担う役割を明らかにするための解析 (組織化学, 免疫染色, TUNEL染色を用いた網膜構成細胞に起こる形態学的変化や細胞死に関する解析、およびDNA損傷修復機構や光酸化ストレス誘導性細胞老化に関する解析) を順次進める予定である。

Causes of Carryover

TopoIIβの機能解析用トランスジェニックメダカ系統を作出し直す必要が生じた。そのため、解析モデルの作出に引き続き実施を計画していた全ての解析実験を先送りする必要が生じ、解析実験で使用を予定していた試薬類、器具類、受託解析サービス等の令和４年度内の購入・利用を止め、令和５年度内に購入・利用することにした。現時点において解析実験の内容に大きな変更予定はないため、令和４年度分の残金は研究計画書の令和３年度分で申請した内容からほぼ変更することなく令和５年度に使用する予定である。