慢性重症アレルギー性角結膜炎におけるIL-33陽性活性化線維芽細胞の機能解析

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K09754
• Research Institution: Juntendo University
• Principal Investigator: 浅田 洋輔 順天堂大学, 医学部, 非常勤助教 (70596626)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 松田 彰 順天堂大学, 大学院医学研究科, 准教授 (00312348)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: アレルギー性結膜炎 / ILC2 / IL-33 / 線維芽細胞

Outline of Annual Research Achievements

慢性重症アレルギー性角結膜炎は青壮年の発症が多く、生活の質の低下を招くのみならず、時に角膜の混濁・不正乱視による永続する視機能障害を引き起こす疾患である。我々の研究グループは慢性重症アレルギー性角結膜炎の病態研究とマウスモデルの樹立に注力する中で、結膜実質の脈管周囲組織におけるIL-33陽性活性化線維芽細胞が慢性重症アレルギー性角結膜炎のマウスモデルで増加していることを発見した。本研究では脈管周囲の活性化線維芽細胞がアレルギー性角結膜炎の慢性化・重症化に果たす役割を明らかにするとともに、IL-33中和抗体を用いた慢性重症アレルギー性角結膜炎治療の有効性をマウスモデルで検証することを目的としている。
慢性重症アレルギー性角結膜炎の病態に結膜線維芽細胞が産生するIL-33と、それによって活性化されるILC2シグナルがどのように関連しているかを明らかにするため、IL-33中和抗体を用いた慢性アレルギー性結膜炎の抑制効果を静脈内投与と点眼投与の２つの異なる投与経路を用いて、比較検証をおこなった。中和抗体の点眼で一定の治療効果は得られることが判明したが、静脈内投与も併用したほうがより治療効果が高いことも判明した。脈管周囲のIL-33陽性線維芽細胞の役割が大きければ、中和抗体の投与経路として静脈内投与がより効果的であることが期待される。今年は組織学的にヒト結膜のサンプルを用いて、脈管周囲のIL-33陽性線維芽細胞を同定した。来年度はさらに新たに採取したAKC/VKC組織を用いてVisum空間的遺伝子発現解析(10xgenomics社)プラットフォームを用いて、組織切片上の単一細胞におけるRNA-seq解析を施行し、IL-33陽性脈管周囲線維芽細胞とILC2細胞を実際のヒト臨床サンプルで同定し、その局在を含めた情報を得る予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

結膜下組織の脈管（血管、リンパ管）周囲のIL-33陽性線維芽細胞(Adventitial stromal cell)が、ILC2細胞の分化増殖をサポートして、アレルギー性角結膜炎
の慢性化・重症化に重要な役割を果たしているのではないかとの仮説の検証のため、以下の３つの目標を設定しており、順調に経過している。
①慢性アレルギー性結膜炎マウスモデルにおけるIL-33陽性線維芽細胞とILC2の共局在を明らかにする
②IL-33欠損マウスを用いた慢性アレルギー性結膜炎モデル、IL-33中和抗体投与下の慢性アレルギー性結膜炎モデルマウスを用いてILC2の存在と活性化状態を検証
③ヒトのAKC/VKC組織におけるIL-33陽性線維芽細胞(Adventitial stromal cell)の同定とsingle cell RNA-seq解析
昨年度は①②を行い報告を行い、今年度は③のうちIL-33陽性繊維芽細胞の同定を行った。計画は順調に進展している。また①に関しては新たなアレルギー性結膜炎モデルを作成し、抗IL-33抗体投与によってアレルギー性結膜炎にたいする治療効果がさらに得られる投与方法を検討していく。

Strategy for Future Research Activity

①の再検証としてIL-5レポーターマウスを用いて、慢性アレルギー性結膜炎モデルを作成し、結膜における脈管周囲のPDGFR-alpha+IL-33+の線維芽細胞との時間的・空間的共局在を免疫組織染色の手法で明らかにしてゆく。
また結果の検証のため、IL-5-RFPマウスの結膜をFACS解析し、RFP陽性細胞群におけるILC2細胞（Linage- ST2+）とそれ以外の細胞（主にT細胞と好酸球と予想される）の存在比を明らかにして、免疫組織染色におけるILC2細胞の同定を確実なものとしてゆく予定である。さらに新たに採取したAKC/VKC組織を用いてVisum空間的遺伝子発現解析(10xgenomics社)プラットフォームを用いて、組織切片上の単一細胞におけるRNA-seq解析を施行し、IL-33陽性脈管周囲線維芽細胞とILC2細胞を実際のヒト臨床サンプルで同定し、その局在を含めた情報を得る予定である。

Causes of Carryover

おおむね順調に実験を行っているが、もともと使用予定であったさらに新たに採取したAKC/VKC組織を用いてVisum空間的遺伝子発現解析(10xgenomics社)プラットフォームを用いて、組織切片上の単一細胞におけるRNA-seq解析を施行し、IL-33陽性脈管周囲線維芽細胞とILC2細胞を実際のヒト臨床サンプルで同定し、その局在を含めた情報を解析予定であり、次年度以降の請求を予定している。