Transfection of plasmid vector for AMPs to wound treatment

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K09765
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 榊原 俊介 神戸大学, 医学部附属病院, 特命講師 (50444592)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 野村 正 神戸大学, 医学部附属病院, 准教授 (30529566) ; 高須 啓之 山口大学, 医学部附属病院, 准教授 (40566022) ; 寺師 浩人 神戸大学, 医学部附属病院, 教授 (80217421) ; 藤井 美樹 順天堂大学, 大学院医学研究科, 准教授 (80444602)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: 抗菌ペプチド / denensin

Outline of Annual Research Achievements

われわれは抗菌ペプチドであるdefensinに注目し、これを培養細胞において強制的に発現させることで細胞が感染への抵抗性を示すことを確認することを第一の目標とした。human defensinはアルファ型とベータ型とに分類され。さらにそのサブファミリーが存在する。これらはそれぞれに抗菌スペクトラムや発現部位が異なることが明らかとなっている。われわれはhuman beta defensin-3に注目した。本ペプチドは広い抗菌スペクトラムを持つためである。殺菌活性は細胞外に分泌して作用しなくてはならず、シグナルペプチドを組み合わせる必要があると考えられた。一方で、各defensinには一次構造にはシグナルペプチドが含まれており、この配列をベクターに組み込むこととして発現ベクターを設計した。この時、CMVプロモータ下流に位置させることとしたが、これとは別に発現が傾向タンパク質により確認できるように双方向性の発現ベクターを選択した。
まずカスタム合成によりhuman defense-3の全長配列を作成した。これに対してPCRを行うことで全長配列を増幅した。この配列をpBIおよびｐBAプラスミドベクターに組み込みを行なっている。得られたクローンの塩基配列を現在確認している。
今後、プラスミドベクターへの組み込みが確認されたのち、ヒト培養皮膚線維芽細胞に導入し、ELISA法などにより培養上澄中に含まれるdefensinの発現量の測定や細菌耐性について検討を行う予定である。この細菌耐性の検討を行うにあたり、病原性を持つ細菌によるモデル化は汎用性に乏しいため、納豆菌によるバイオフィルム形成実験も併せて行なっている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

プラスミドベクターの設計・構築を行なっており、およそ予定通りの進捗である。

Strategy for Future Research Activity

プラスミドベクターに目的とするdefensinの挿入を確認したのち、ヒト皮膚線維芽細胞にtransfectionを行う。培養上澄中に含まれるdefensin量をELISA法により定量化する。
次に納豆菌を用いた培養液中に培養上清を混じ、その増殖の阻害について検討を行う予定である。

Causes of Carryover

研究計画は概ね順調に進んでいるが、一部試薬が他の研究課題でも共通で使用することがあったなどにより、経費が削減された。