Transfection of plasmid vector for AMPs to wound treatment

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K09765
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 榊原 俊介 神戸大学, 医学部附属病院, 特命講師 (50444592)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 野村 正 神戸大学, 医学部附属病院, 准教授 (30529566) ; 高須 啓之 山口大学, 医学部附属病院, 准教授 (40566022) ; 寺師 浩人 神戸大学, 医学部附属病院, 教授 (80217421) ; 藤井 美樹 順天堂大学, 大学院医学研究科, 准教授 (80444602)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: 抗菌ペプチド

Outline of Annual Research Achievements

われわれは抗菌ペプチドであるdefensinに注目し、これを培養細胞において強制的に発現させることで細胞が感染への抵抗性を示すことを確認することを第一の目標とした。human defensinはアルファ型とベータ型とに分類され。さらにそのサブファミリーが存在する。これらはそれぞれに抗菌スペクトラムや発現部位が異なることが明らかとなっている。われわれはhuman beta defensin-3に注目した。本ペプチドは広い抗菌スペクトラムを持つためである。
まずカスタム合成によりhuman defensin-3の全長配列を含む発現ベクターを次の通り構築した。1.　DYKタグをhuman defense-3のC末端に付加したもの、2. バイダイレクショナルベクターであるpBIに組み込んだもの、3.pBAに組み込んだもの　を作成した。1.をヒト線維芽細胞に導入したのち、培養上澄を回収し、これに対して抗DYK抗体を用いて発現を確認したところ、確かにDefensin-3が発現し、かつ、細胞外に分泌されていることが明らかとなった。次にpBIに組み込んだものを線維芽細胞に導入し、導入効率を確認するために蛍光タンパク質を用いて観察したところ、トランスフェクション試薬を利用した場合は細胞死率が高く、導入効率が低かったため、エレクトロポーレーショんによる導入とした。この結果をもとにpBAに組み込んだものを利用し、western blottingにより定量観察を行ったがup-regurationが認められなかった。培養上澄により希釈されている可能性を考慮し、BSAに対する抗体によりベースラインを作成することとし、現在、継続している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

発現系の確率が行えた。

Strategy for Future Research Activity

上記2.により蛍光を用いて導入効率を確認しながらhuman defensin-3の発現を確認する。さらにBSAを基準としながら上記3.（pBAに組み込んだもの）を線維芽細胞に導入し、一定の発現が確認されたのち、細菌との共培養により生存確率の上昇が認められるのかを検証する。

Causes of Carryover

使用する試薬が他の研究課題と共通であったため、それらを利用したため。