Transfection of plasmid vector for AMPs to wound treatment

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K09765
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 榊原 俊介 神戸大学, 医学部附属病院, 特命講師 (50444592)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 野村 正 神戸大学, 医学部附属病院, 准教授 (30529566) ; 高須 啓之 山口大学, 医学部附属病院, 准教授 (40566022) ; 寺師 浩人 神戸大学, 医学部附属病院, 教授 (80217421) ; 藤井 美樹 順天堂大学, 大学院医学研究科, 准教授 (80444602)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: 抗菌ペプチド

Outline of Annual Research Achievements

われわれは抗菌ペプチドであるdefensinに注目し、これを培養細胞において強制的に発現させることで細胞が感染への抵抗性を示すことを確認することを第一の目標とした。human defensinはアルファ型とベータ型とに分類され。さらにそのサブファミリーが存在する。これらはそれぞれに抗菌スペクトラムや発現部位が異なることが明らかとなっている。われわれはhuman beta defensin-3に注目した。本ペプチドは広い抗菌スペクトラムを持つためである。
昨年度までにhuman defensin-3の全長配列を組み込んだ発現ベクター(pBA, pBI)を作成した。これらをヒト線維芽細胞にエレクトロポーレーションにより導入し、培養上澄における発現量の変化の定量化を試みたが発現量が低く、本年度は細胞量・プラスミド量の調整を要した。その結果、線維芽細胞において安定した発現量を得ることが可能となった。次に、培養上澄中に含まれるdefensin量の変化を経時的に測定した。いまだpreriminaryなデータではあるが、導入後3日目が最も発現量が多く、約1週間でコントロールと同様の発現量まで戻った。つまり、プラスミドベクターによる影響が1週間程度で消失することが示唆された。
次に、培養上澄を採取し、これを希釈しながら大腸菌と共培養した。長時間の培養ではいずれも大腸菌は増殖したが、短時間においては、濃度依存的に大腸菌の発育を抑制する結果となった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

defensinの発現が安定している。

Strategy for Future Research Activity

defensinの経時的な発現量の変化をN数を増やしてさらに検討を行う。また、プラスミドの遺残についてPCRにより確認する。
さらに、エンドトキシンを発現しない細菌培養下でのdefensinの効果を検討する。

Causes of Carryover

使用する試薬が他の研究課題と共通であったため、それらを利用したため。