自家移植を目指した機能性エクリン汗腺を含有する三次元培養表皮の開発

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K09769
• Research Institution: Ehime University
• Principal Investigator: 亀田 健治 愛媛大学, 医学系研究科, 研究員 (60363264)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 村上 正基 愛媛大学, 医学系研究科, 特任教授 (20278302) ; 森 秀樹 愛媛大学, 医学系研究科, 講師 (60325389)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: 再生医療 / エクリン汗腺 / 三次元培養

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は、現在までに改良されてきた皮膚三次元培養表皮をさらに進化させ、機能性エクリン汗腺を含有する三次元培養皮膚の新規作成法を確立し、臨床応用を目指すことである。我々は、さらにエクリン汗腺の機能を有する次世代型の表皮シートあるいは自家培養皮膚の開発を目指す点において独自性・独創性がある。今回我々は、将来の基礎研究及び臨床応用に十分に貢献できる次世代型の三次元培養皮膚モデルの作製を目指すが、その結果を国内国外へ発信することで、多数の皮膚疾患患者に対する臨床応用へ発展されていくことを強く切望する。
多指症患者から得られた指尖部より、エクリン汗腺を維持中に増殖した汗管、汗腺細胞を単離培養し、含有される幹細胞の同定・単離をlabel retaining法及び免疫染色にて行う。胎性幹細胞からの角化細胞への誘導についてはFAD培地にて培養し、その後BMPとアスコルビン酸添加することによりケラチン陽性細胞を誘導、さらに角化細胞用培地に変更し角化細胞の増殖を高め、継代することにより間葉系細胞の割合を減らしていく方法で、全経過として約1ヶ月以上を要する。表皮幹細胞が存在する基底層に多いK5陽性細胞の分離条件などを参考にして細胞を単離する。分離後再増殖させた単離細胞内での多能性幹細胞（PSC）は、フローサイトメトリーによりTRA-1-60、TRA-1-81、SSEA3などのマーカーによりソーティングにて同定・回収する。免疫染色することにより増殖した細胞の性質を確認する。
エクリン汗管細胞及び腺房細胞を、オルガノイド培養法・マトリゲル培養にてスフェロイド培養を行なう。その後エクリン汗腺細胞から組織への分化誘導を行うために、ヒト角化細胞を用いた単層培養あるいは三次元培養表皮形成中にエクリン汗腺のスフェロイドを挿入し共培養を行い、正常皮膚同様に気相内での表皮内汗管形成誘導を行なう。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

表皮幹細胞が存在する基底層に多いK5陽性細胞の分離条件などを参考にして、表皮幹細胞マーカーMelanoma- associated chondroitin sulfate proteoglycan (MCSP)陽性細胞を単離した。分離後、再増殖させた単離細胞内での多能性幹細胞（PSC）は、フローサイトメトリーによるTRA-1-60、TRA-1-81、SSEA3、およびSSEA4をマーカーとしたソーティングして解析した。
Organ cultureにて得られた汗管細胞・腺房細胞を其々分化誘導培地にてさらに培養を行う。角化細胞誘導培地に変更後、上皮系マーカー(ケラチンK5, K14, K1, K10等など)、汗腺系マーカー（CEA、GDCFP-15など）を免疫染色することにより増殖した細胞の性質を確認したが、今のところ特に有為な差は見られていない。
得られたエクリン汗管細胞及び腺房細胞を、オルガノイド培養法・マトリゲル培養にてスフェロイド培養をおこなた。その後発育させた未熟なエクリン汗腺細胞からエクリン汗腺組織への分化誘導を行うために、ヒト角化細胞を用いた単層培養あるいは三次元培養表皮形成中にエクリン汗腺のスフェロイドを挿入し共培養を行い、正常皮膚同様に気相内での表皮内汗管形成誘導を行う。機能マーカー(各種ケラチン(K5, K14, K1, K10等)、involucrin, loricrin, TGase1等) を免疫染色し、三次元構造形成及び分化について３Dイメージングを用いて現在確認している。

Strategy for Future Research Activity

多指症患者から得られた指尖部より、エクリン汗腺のorgan cultureを今後継続的に行う。維持中に増殖した汗管、汗腺細胞を単離培養し、含有される幹細胞の同定・単離をlabel retaining法及び免疫染色にて行う。胎性幹細胞からの角化細胞への誘導についてはFAD培地にて培養し、その後BMPとアスコルビン酸添加することによりケラチン陽性細胞を誘導、さらに角化細胞用培地に変更し角化細胞の増殖を高め、継代することにより間葉系細胞の割合を減らしていく方法で、全経過として約1ヶ月以上を要する。表皮幹細胞が存在する基底層に多いK5陽性細胞の分離条件などを参考にして、表皮幹細胞マーカーMelanoma- associated chondroitin sulfate proteoglycan (MCSP)陽性細胞を単離する。
分離後再増殖させた単離細胞内での多能性幹細胞（PSC）は、フローサイトメトリーによるTRA-1-60、TRA-1-81、SSEA3、およびSSEA4をマーカーとしたソーティングにて同定および回収する。得られたエクリン汗管細胞及び腺房細胞を、オルガノイド培養法・マトリゲル培養にてスフェロイド培養を行う。その後発育させた未熟なエクリン汗腺細胞からエクリン汗腺組織への分化誘導を行うために、ヒト角化細胞を用いた単層培養あるいは三次元培養表皮形成中にエクリン汗腺のスフェロイドを挿入し共培養を行い、正常皮膚同様に気相内での表皮内汗管形成誘導を行う。機能マーカー(各種ケラチン(K5, K14, K1, K10等)、involucrin, loricrin, TGase1等) を免疫染色し、三次元構造形成及び分化について３Dイメージングを用いて確認する。

Causes of Carryover

フローサイトメトリーによるTRA-1-60、TRA-1-81、SSEA3、およびSSEA4をマーカーとしたソーティングして解析し,
Organ cultureにて得られた汗管細胞・腺房細胞を其々分化誘導培地にてさらに培養を行った。角化細胞誘導培地に変更後、上皮系マーカー(ケラチンK5, K14, K1, K10等など)、汗腺系マーカー（CEA、GDCFP-15など）を免疫染色することにより増殖した細胞の性質を確認したが、今のところ安定したデーターが取れていないため、何度かの追試が必要となったため。

Research Products

• [Journal Article] Highly concentrated trehalose induces prohealing senescence-like state in fibroblasts via CDKN1A/p21 (2023)
  • Author(s): Muto J, Fukuda S, Watanabe K, Dai X, Tsuda T, Kiyoi T, Kameda K, Kawakami R, Mori H, Shiraishi K, Murakami M, Imamura T, Higashiyama S, Fujisawa Y, Mizukami Y, Sayama K
  • Journal Title: Commun Biol. Volume: 6(1) Pages: 1-18
  • DOI: 10.1038/s42003-022-04408-3
  • Peer Reviewed / Open Access