Effect of peripheral blood-derived epidermal stem cells in diabetic wound repair and its underlying mechanism

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K09801
• Research Institution: Juntendo University
• Principal Investigator: 大森 愛 順天堂大学, 医学部, 助手 (60897156)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 表皮幹細胞 / 糖尿病性潰瘍 / 創傷治癒

Outline of Annual Research Achievements

糖尿病性潰瘍の多くは難治性であり、特に治療に抵抗性のある下腿潰瘍は最終的に切断に至ることが多い。下肢切断後の5年生存率は35%前後と予後不良である。これまでの皮膚潰瘍治療のための持続陰圧閉鎖療法、高圧酸素療法、熱、光線、極超短波、電気、超音波、振動などの物理的刺激手段を用いる物理療法やbFGF投与する既存の治療法があったが、既存の治療法に抵抗があった症例は少なくない。皮膚潰瘍治療の１つとして再生医療に大きな期待が寄せられているが、糖尿病では表皮幹細胞の機能や再生能力が低下する問題がある。申請者は健常ヒト末梢血から単離した単核球（MNC）を独自に開発した生体外培養法を適用することで、表皮幹細胞マーカーの発現（MNC-EK細胞調製）および創傷移植へ供する方法を考案した。本研究では糖尿病皮膚潰瘍治療のため、創傷における表皮幹細胞の供給源・再生抑制の機序解明を目的とする。健常者および糖尿病患者から採取したMNCからMNC-EK細胞を調製する方法を確立し、それぞれの移植成績を評価することで糖尿病における再生能力低下要因を特定する。本成果により、MNC-EK細胞を用いた糖尿病性潰瘍治療の基盤が確立され、革新的皮膚再生治療法の樹立を目指す。
令和３年度では、ヒト末梢血からMNCを単離し、共培養法と生体外培養法でそれぞれ分化誘導を行い表皮幹細胞の特性を評価した。健常人のMNCをそれぞれの方法で培養すると両者共にKeratin陽性細胞へ分化することが確認できた。また、MMC-EK細胞の特性はコロニーアッセイで評価した。具体的には、3cmの細胞培養ディッシュに2x10^4個のMNC-EK細胞を播種し、21日間培養を行い、培養後MNC-EKのコロニー数をカウントし、MNC-EK細胞の自己複製特性を観察した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

令和３年度では、ヒト末梢血からMNCを単離し、共培養法と生体外培養法でそれぞれ分化誘導を行い、培養後のMNC-EK細胞特性はコロニーアッセイで評価した。その結果MNC-EK細胞の自己複製特性を同定できた。

Strategy for Future Research Activity

令和３年度の研究成果に基づいて、調製したMNC-EK細胞を潰瘍領域へ移植し、創傷治癒効果を評価する。具体的には、免疫不全モデルBALB/cAJcl-nu/nuマウスへstreptozotocin（STZ）を投与することで1型糖尿病を誘導した後、背部皮膚にステント潰瘍を作製して評価に用いる。MNC-EK細胞を潰瘍の筋膜下に移植し、タイムコースで皮膚潰瘍部位の面積測定と組織回収を行う。皮膚細胞再生する時の変化を免疫染色法を用いて可視化し、糖尿病性潰瘍での皮膚細胞の局在及び局在量を検討する。

Causes of Carryover

令和３年度では学会に参加しない為、旅費交通費を生じない。使用計画として、高価な免疫不全モデルマウスに研究経費を支出する。