ノックアウトマウスとレポーターマウス作製によるType I Runx2の機能解明

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K09819
• Research Institution: Nagasaki University
• Principal Investigator: 松尾 友紀 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 技術職員 (40792601)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小守 壽文 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 教授 (00252677) ; 森石 武史 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 助教 (20380983) ; 大庭 伸介 大阪大学, 大学院歯学研究科, 教授 (20466733)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: Runx2 / Type I Runx2 / Type II Runx2 / P1プロモーター / P2プロモーター / 骨形成 / 骨芽細胞 / 軟骨細胞

Outline of Annual Research Achievements

Runx2は、間葉系幹細胞から前骨芽細胞への分化を誘導、さらに未熟骨芽細胞へと分化を誘導し、骨基質タンパク産生にも関与する。また、軟骨細胞の後期分化にも必須の転写因子であり、骨形成において主要な役割を担っている。Runx2は、2つのプロモーター（P1, P2）によって転写が制御されており、P1プロモーターから転写されるType II Runx2ノックアウトマウスは、Runx2ノックアウトマウスと比較し、骨形成異常は比較的軽微である。このため、P2プロモーターから転写されるType I Runx2が骨形成に重要な働きをすることが推測される。Type I Runx2の機能を明らかにし骨形成機構の理解を深めるために、昨年度Ｐ2プロモーターを欠失および変異させ野生型Type II Runx2のみを発現できるType I Runx2欠失マウスの作製に成功した。
当該年度は、このType I Runx2欠失マウスから胎生15.5日と18.5日のマウスの骨格標本を作製し、骨・軟骨形成について検討した。この結果、明らかな骨・軟骨形成遅延は認められなかった。このため、Runx2ヘテロマウスとの交配により、Type I Runx2 / Runx2ヘテロマウスを作出し、その骨格標本での骨・軟骨形成を検討している。また、これまでのP2プロモーターのトランスクリプトーム解析Cap Analysis of Gene Expression （CAGE）の結果から、P2プロモーターの転写開始点は複数あることが予想されたため、このType I Runx2欠失マウスについてもCAGEを行い、転写開始点の同定が必須と考えられた。このため、胎生15.5日の四肢および18.5日の頭蓋冠からRNAサンプルの収集を行った。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

Type I Runx2欠失マウスの骨格標本により、骨・軟骨形成に明らかな遅延がみられなかったことから、まずは転写開始点の検討が必須であることが明らかにできた。

Strategy for Future Research Activity

CAGE解析を行い、Type I Runx2欠失マウスの転写開始点を同定し、Type I Runx2の生理的意義を検討する。成獣での骨量の変化をとらえることを目的とし、10週齢の大腿骨でのマイクロCTを行い、骨形成への影響を調べる。
Runx2の生理的発現を再現できるレポーターマウスとP1プロモーターレポーターマウス、P2 プロモーターレポーターマウスの交配により、Runx2アイソホームの時間的・空間的パターンを同定する。

Causes of Carryover

使用予定の血清マーカーキットが製造中止となり、他社のキットの購入を検討しているが、安定した結果を得られず難航しているため。繰越額は、代替キットの購入代として使用予定である。