2022 Fiscal Year Research-status Report
唾液腺感受性亢進におけるβアレスチンシグナル経路の関与とその分子機構の解明
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21K09821
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| Research Institution | The Nippon Dental University |
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Principal Investigator |
森田 貴雄 日本歯科大学, 新潟生命歯学部, 教授 (20326549)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
根津 顕弘 北海道医療大学, 歯学部, 准教授 (00305913)
竹澤 晴香 (山口晴香) 日本歯科大学, 新潟生命歯学部, 講師 (00756942)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 唾液分泌 / ピロカルピン / βアレスチン / ムスカリン / MAPキナーゼ / 遺伝子発現 / 唾液腺培養細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ピロカルピンは唾液分泌促進薬として使用されており、長期の連続服用により唾液分泌量が増加することが知られているが、その分子メカニズムは解明されていない。そこで本研究は、ピロカルピンの長期投与による唾液分泌量増加の分子メカニズムを明らかにすることを目的とする。
１）唾液腺由来培養細胞であるHSY細胞を用いて、ピロカルピン刺激による遺伝子発現変化を解析した。HSYにおいてもラットと同様に、ピロカルピン刺激によりCtgfおよびSgk1のmRNA発現量は、無刺激のコントロールに比べて有意に増加した。このCtgf遺伝子の発現増加効果は、MAPキナーゼキナーゼ（MAPKK, MEK）の阻害により抑制されたが、βアレスチンシグナルの阻害剤では抑制されなかった。対して、ピロカルピンによるSgk1のmRNA発現量の増加効果は、βアレスチンシグナルの阻害により抑制された。これらのことから、CtgfとSgk1遺伝子の発現調節は異なる細胞内シグナル経路を介していると考えられる。
２）HSY細胞をピロカルピンで刺激し、MAPK (p44/42) のリン酸化を解析したところ、ピロカルピン刺激15分後ではリン酸化量の増加が観察されたが、1日後ではリン酸化の増加効果は見られなかった。
３）ラットと同様に、マウス（C57BL/6）にピロカルピンを２回投与し、唾液分泌量を測定したところ、１回目の分泌量より２回目の分泌量が有意に増加していた。
マウスにMEK阻害剤を腹腔内投与し、その１時間後にピロカルピン刺激による唾液分泌を測定した。さらにその１週間後のピロカルピン刺激による唾液分泌量を測定し、１回目の分泌量と比較した。MEK阻害剤を前投与したマウスでは、２回目の唾液分泌亢進作用が見られなかった。これらのことから、ピロカルピン２回投与による唾液分泌亢進作用には、MAPキナーゼ系が関与していると考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
目的分子の発現解析を、組織スライス標本を用いた免疫組織（細胞）化学法で行うことを計画した。しかし、当研究室において標本作製および染色法の実験系が確立されていなかった。本年度は組織スライス作製およびHE染色法までの実験を行ったが、免疫染色法はまだ実施しておらず、この点で実施が遅れている。
動物への遺伝子導入及びノックダウンによる機能解析がまだ実施できておらず、この点で遅れている。
マウスへの阻害剤の全身投与により、ピロカルピンの２回投与による唾液分泌量の亢進の抑制が観察された。この唾液分泌量変化に対する動物への阻害剤投与の結果により、本研究は予定よりも大きく伸展している。
これらのことから全体的に見て、研究はやや遅れている。
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| Strategy for Future Research Activity |
目的分子の唾液腺組織における発現解析を、組織スライス標本を用いて行う。今年度（令和４年度）は当研究室において組織標本の作製及びHE染色法の実施環境が整った。今後はこの標本を使って免疫染色法を実施する。
培養細胞を用いた遺伝子発現解析実験で効果の見られた阻害剤を、ラットまたはマウスに投与し、ピロカルピン刺激による唾液分泌量にどのような影響を与えるのかを解析する。それと同時に、投与した動物から唾液腺を単離し、発現変化の見られた遺伝子の発現量を解析し、これらの阻害剤が唾液分泌量および遺伝子発現変化にどのような影響を与えるかを明らかにする。
動物の唾液腺に目的分子を強制発現またはノックダウンさせ、唾液分泌に対する影響を解析する。
HSY細胞あるいは他の培養細胞（神経由来SH-SY5Yなど）を用いて、他のムスカリン受容体アゴニスト（セビメリンなど）やモジュレーターなどの刺激による遺伝子発現変化を解析する。さらに、遺伝子発現に変化の見られた薬物をマウスやラットに投与し、唾液分泌量の変化に対する効果を検討する。
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| Causes of Carryover |
今年度は動物におけるin vivoの機能解析が十分にできず、使用動物数が予定より減ってしまったため、当該金額が生じた。翌年度に、この金額を加算して動物を用いた機能解析実験を行う。
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Research Products
(6 results)
