2021 Fiscal Year Research-status Report
Identification of mechano-memory for regulating promotion/suppression of osteoclast differentiation
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21K09824
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| Research Institution | Osaka Dental University |
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Principal Investigator |
納富 拓也 大阪歯科大学, 歯学部, 講師 (70542249)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 破骨細胞 / 力学的刺激 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
骨中力学的刺激伝達機構の研究は、力学的刺激応答性の明確な骨芽細胞を中心に発展しており、骨吸収を担う破骨細胞では、ほとんど検討されていない。特に、破骨細胞分化と力学的刺激について、その影響は刺激条件次第で正反対の結果（分化促進もしくは抑制）となる。これは、破骨細胞の力学的刺激応答性に力学的閾値(Mechano-threshold)が存在することを示す。本計画では、破骨細胞分化方向を決定する力学的閾値を仮定して、それを土台とする力学的刺激記憶機構（Mechano-memory：力学的刺激終了後、長期に渡り細胞内シグナル伝達機構が活性化され続ける）の同定と解明に挑む。本年度では、細胞伸展刺激における力学的閾値同定のための条件スクリーニングを主として実施した。破骨細胞分化の指標として、タンパク量で標準化したTRAP活性を用いた。また、前破骨細胞から破骨細胞への分化期間を短縮してスクリーニングを進めるために、樹立したRANKLに高い反応性を示す細胞株（RAW-H）を用いた。分化・培養期間5日間、伸展時間5分×1、伸展回数1日1回の条件では、伸展率(0-30%)の増加に伴い、TRAP活性も増加した。伸展時間を10-20分に漸増させて、同様の条件で行ったが、伸展率(0-30%)の増加に伴い、TRAP活性が増加した。次に、1日の伸展時間の繰り返し回数を変化させて実験を行ったところ、3回目までは、TRAP活性が増加したが、5回以上になると、TRAP活性が減少した。これを基に、検討を進め、繰り返し回数と力学的閾値の関連性を示唆する結果（繰り返し回数により、破骨細胞分化が増加もしくは抑制する）を得た。また、マウス骨髄細胞由来の破骨細胞を用いた検討においても類似の結果が得られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
力学的閾値の条件スクリーニングは、条件検討に時間を要するが、順調に進んでおり、力学的閾値のいくつかの条件を同定しつつある。また、CRISPR/CAS9による関連分子を欠損したRAW細胞を作成中であり、それを用いる条件検討を開始する。それとともに、ウェスタンブロッティングによるERK比率の同定をTRAP活性測定とともに準備している。
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| Strategy for Future Research Activity |
力学的閾値の発生条件については、引き続き検討を進める。ERK比率による力学的閾値の検討では、TRAP活性を指標としたデータの関連性を検討可能とするための基礎データ取得を目指して、実験回数を増加していく。関連分子の同定については、NMDA受容体について焦点をあてているが、関連するイオンチャネルの阻害薬も用いて検討を進める。
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| Causes of Carryover |
所属部署変更のため、動物実験計画書変更とその認可まで時間を要したことと、大学共通施設利用のための準備が遅れたためである。また、力学的刺激装置の故障のため、計画をしていた実験回数が大きく減少して、消耗品消費が少なくなったことである。実験回数の減少に応じて、人件費・消耗品費の減少が生じた。
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