2022 Fiscal Year Research-status Report
Identification of mechano-memory for regulating promotion/suppression of osteoclast differentiation
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21K09824
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| Research Institution | Wakayama Medical University |
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Principal Investigator |
納富 拓也 和歌山県立医科大学, 医学部, 講師 (70542249)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 破骨細胞 / 力学的刺激 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
骨中力学的刺激伝達機構の研究は、力学的刺激応答性の明確な骨芽細胞を中心に発展しており、骨吸収を担う破骨細胞では、ほとんど検討されていない。特に、破骨細胞分化と力学的刺激について、その影響は刺激条件次第で正反対の結果（分化促進もしくは抑制）となる。これは、破骨細胞の力学的刺激応答性に力学的閾値(Mechano-threshold)が存在することを示す。本計画では、破骨細胞分化方向を決定する力学的閾値を仮定して、それを土台とする力学的刺激記憶機構（Mechano-memory：力学的刺激終了後、長期に渡り細胞内シグナル伝達機構が活性化され続ける）の同定と解明に挑む。
本年度では、力学的閾値のスクリーニング結果に基づき、その再現性とシグナル伝達機構の重要分子について検討を進めた。長期間（7日間以上）の力学的刺激後にERK比率（リン酸化ERK/全ERK）が増加していることを背景として、グルタミン酸受容体（NMDA受容体）を標的分子の一つとして検討した。NMDA受容体のサブユニットのNR1が破骨細胞前駆細胞にて検出されて、免疫染色により、その局在を確認した。また、NMDA受容体の可逆的阻害薬を伸展刺激時に添加すると、長期伸展刺激後のERK比率増加が認められなかった。TRAP活性減少条件下（力学的閾値以上の伸展条件）において、NMDA受容体阻害薬を添加すると、力学的刺激による破骨細胞分化抑制効果が確認されなかった。これは、RAW細胞および骨髄由来細胞の破骨細胞を用いた検討においても、同様の結果が得られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
力学的刺激記憶機構（長期間刺激後の持続的シグナル変化）との関連については、グルタミン酸受容体を代表として、いくつかの標的候補分子を薬物スクリーニングにて確認しつつあるが、再現性を得るために時間を要する。また、候補分子をCRISPR/CAS9システムにて欠損させたRAW細胞を作成中である。それらを用いながら、力学的刺激閾値との関係性を検討している。
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| Strategy for Future Research Activity |
力学的刺激閾値のスクリーニングについては再現性がとれてきており、閾値前後の条件を用いて実験を進めていく。破骨細胞分化との関連性について、迅速に評価をおこなうために、引き続きTRAP activityを指標として検証する。標的分子については、分子数を絞って、CRISPR/CAS9による遺伝子欠損細胞を順次作成していく。作成済みの遺伝子欠損細胞では、遺伝子欠損の検証をウエスタンブロッティング法にて行ったのち、実験に用いる。マウスを用いた実験については、野生型マウスに、細胞レベルでの閾値条件と類似した負荷をかけて、生体内での閾値の存在を検証する。
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| Causes of Carryover |
所属部署変更のため、引き続き実験系の立ち上げと移行が遅れたためである。また、力学的刺激装置の不具合が生じたため、実験回数が予定していた回数を実施できなかった。この実験減少に応じて、消耗品費の減少が生じた。
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