2022 Fiscal Year Research-status Report
外分泌細胞における余剰分泌顆粒の安全な処理機構としてのクリノファジーの役割
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21K09836
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
吉垣 純子 日本大学, 松戸歯学部, 教授 (40256904)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | クリノファジー / 唾液腺 / 分泌顆粒 / タンパク質分解 / オートファジー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
唾液腺腺房細胞における分泌顆粒の処理機構を解析するために，唾液タンパク質であるシスタチンD（Cst5）とHaloTagとの融合タンパク質（Cst5-Halo）を耳下腺初代培養細胞に発現させ，細胞内半減期の測定を行った。Cst5-Haloを発現した細胞をHaloTag TMRリガンドでラベルした後，未結合リガンドを除去し，0-8時間培養を行った。細胞を回収し，残存するTMRラベルされたCst5-Haloの量の変化を測定したところ，細胞内半減期は約３時間であった。次に，形成されてから時間が経過した分泌顆粒と新規に形成された顆粒の細胞内動態の違いを解析するために，Cst5-Haloを発現した唾液腺初代培養細胞をTMRリガンドでラベル後，未結合のリガンドを除去し3-24時間培養した。その後，Oregon Greenリガンドでラベルして，新旧の分泌顆粒の染め分けを試みた。時間経過と共にOregon Green 陽性の分泌顆粒は増えたが，24時間後でもTMRでラベルされた分泌顆粒が観察された。唾液腺の分泌顆粒はβアドレナリン受容体刺激で開口放出が促進される。新旧の分泌顆粒の分泌能を調べるために，TMRリガンドでラベルした後，未結合リガンドを除去し，3-6時間培養してからβアゴニストであるイソプロテレノール非存在下および存在下でインキュベートした。細胞と培地を回収しAlexaFluor 660リガンドでラベル後，電気泳動してゲルイメージングでそれぞれの色素でラベルされたCst5-Haloの分泌量を求めた。その結果，TMRラベルされたCst5-HaloはAlexaFluor 660ラベルされたCst5-Haloよりも非刺激時の分泌量が高かった。したがって，古くなった分泌顆粒は分泌刺激による制御を受けにくくなっていることが予想された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
リソソームと分泌顆粒の融合を可視化するために，生細胞内でリソソームをラベルすることを試みた。リソソーム染色試薬であるCellLight Lysosomes-GFP, BacMam 2.0を使用したが，唾液腺初代培養細胞でタンパク質の発現がほとんど見られなかったため，Cst5-Haloとの共染色ができなかった。そこで，酸性オルガネラに蓄積する色素であるDND-99により細胞を染色し，Cst5-Haloが局在する分泌顆粒内のpH変化によってクリノファジーを検出するシステムを開発することに切り換えることにした。新旧の分泌顆粒は時間差で２色の蛍光リガンドを添加することによって，染め分けることができることを確認した。一方，生化学的な解析として，２つのHaloTagリガンドによる二重ラベルを行い，新旧の分泌タンパク質の細胞内動態を計測した。分泌顆粒の時間経過による分泌能への影響がとらえられたので，この系を利用して分泌顆粒の老化（時間経過による変化）について検討を進めていく予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
新旧に染め分けた分泌顆粒の細胞内動態を解析し，分泌顆粒の時間経過による変化と品質管理機構を明らかにすることを目指す。
1. クリノファジーの形態学的観察：Cst5-Haloおよび他の唾液タンパク質とHaloTagとの融合タンパク質の遺伝子を耳下腺初代培養細胞に導入して分泌顆粒に発現させる。２色のHaloTag蛍光リガンドを用いて新旧の分泌顆粒を染め分け，細胞内局在の違いを調べる。耳下腺初代培養細胞は細胞極性を維持しており，頭頂側と基底膜側の構造に違いがみられる。分泌顆粒の開口放出は頭頂側で起こるため，頭頂側からの距離で分泌しやすさが変化することが予想される。そこで，共焦点レーザー顕微鏡を用いて，培養ディッシュ底面からの距離による新旧の分泌顆粒の存在率を測定する。また，2色のHaloTagリガンドでラベルした後にDND-99で染色し，共局在率が新旧の分泌顆粒で異なるかを解析する。
2. クリノファジーの生化学的な定量：HaloTag融合タンパク質を時間差で２色の蛍光リガンドでラベルし，非刺激時および刺激時における分泌能の違いと細胞内半減期の違いを測定する。
3. クリノファジー誘導の試み：これまでにDND-99の分泌顆粒への局在を調べたが，DND-99のシグナルが検出される分泌顆粒はみられたが，少数であった。通常の培養状態ではクリノファジーの頻度は低いことが予想される。そこで，細胞ストレスとして活性酸素を発生させるメナジオンやアポトーシスを誘導するTNFを添加し，クリノファジー誘導を試みる。DND-99の分泌顆粒への局在や，HaloTag融合タンパク質の半減期への影響を測定し，クリノファジーの分子機序の解析を行う。
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| Causes of Carryover |
リソソーム染色試薬CellLight Lysosomes-GFP, BacMam 2.0を使用してリソソームと分泌顆粒の融合を観察する予定であったが，期待通りにリソソームが染色されなかったため，購入数を減らした。代わりに令和5年度にリソソームに蓄積する色素であるDND-99を購入して実験に用いる予定である。
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