2021 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of the Mechanism of COVID-19-Induced Taste Disorders: An Approach Based on ACE2-BDNF Linkage
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21K09847
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| Research Institution | Kanagawa Dental College |
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Principal Investigator |
河田 亮 神奈川歯科大学, 歯学部, 講師 (30329198)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
猿田 樹理 神奈川歯科大学, 歯学部, 教授 (30454151)
杉本 昌弘 東京医科大学, 医学部, 教授 (30458963)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | COVID-19 / 味覚障害 / 味蕾 / ACE2 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
COVID-19の症状の1つとして味覚障害が認められ、現在までの研究では、嗅覚に関連する支持細胞にSARS-CoV-2の感染が生じ細胞障害による影響が示唆されている。しかし、申請者の研究では、味細胞にもSARS-CoV-2の直接的な感染を引き起こす可能性が明らかなことから、味覚障害の原因がSARS-CoV-2の味細胞への感染による細胞代謝の異常が示唆される。すなわち、「COVID-19の味覚障害には、SARS-CoV-2の味細胞への感染に伴うACE2の発現低下による代謝障害が影響するか」という極めて重要な学術的な問いを見出すに至った。本研究では、この学術的な問いに応えるために、味細胞培養細胞株および遺伝子改変動物を用いて分子生物学にそのメカニズムを明らかにすることを目的としている。
今年度の味細胞培養細胞株を用いた実験系は、偽型SARS-CoV-2侵入におけるACE2、TMPRSS2、Furinの感染への役割を解明するためにPseudo Host／Pseudo SARS-CoV-2 BacMam Systemで、味蕾由来培養細胞に偽型SARS-CoV-2を培養液に添加し、この偽型ウイルスが細胞に侵入するかの確認を行った。遺伝子改変動物を用いた実験系は、ACE2ノックアウトマウスにおける味覚異常メカニズムを解明するために、今年度からACE2ノックアウトマウスの繁殖を開始した。同時に数匹の老齢ノックアウトマウスを用いてH-E染色による舌乳頭に存在する味蕾の組織学的検索を行い味蕾の数や大きさなどの確認を行った。その結果次のような知見が得られた。先ず培養味細胞における遺伝子発現量の解析をRT-PCR法を用いて行ったところ、ACE2遺伝子の発現量が想定より少なかった。但し、新規に購入した味細胞株の培養条件について、いくつか見直す必要があるため、現在培養液の成分調整などをしながら確認実験をすすめている。次にACE2KOマウスの舌のH-E染色像を観察したところ、茸状乳頭や有郭乳頭に存在する味蕾が認められた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
新規に購入した不死化味細胞株の増殖効率が悪かったために、味細胞の遺伝子発現やタンパク質発現の解析を予定通りに進めることができなかった。また味細胞におけるACE2遺伝子の発現量が想定よりも少なかったことから、実験当初の仮説である「COVID-19の味覚障害には、SARS-CoV-2の味細胞への感染に伴うACE2の発現低下による代謝障害が影響する」についても再度検討する必要がある。
一方、遺伝子改変動物を用いた研究については、ACE2ノックアウトマウスを共同研究者から提供してもらったため当初の予定通り繁殖を開始し、同時にH-E染色による形態観察も進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
先ず味細胞の培養実験系は、購入した不死化味細胞株の培養条件などを再度検討して、増殖を図りながら、従来使用していた味細胞株も用いて遺伝子発現やタンパク質発現の解析を行う予定である。その結果、今年度の研究結果と同じく味細胞におけるACE2遺伝子発現が想定よりも少ない場合には、ACE2以外のTMPRSS2やFurinなどの発現低下が、COVID-19の味覚障害の発現に影響している可能性についても考察を進めていく予定である。
次に遺伝子改変動物を用いた研究については、現在飼育中のACE2ノックアウトマウスを繁殖させ系統維持を図る。そして各週齢・月齢のH-E染色による味蕾の組織学的検索を行い味蕾の数や大きさなどの状態を確認し、BDNFの発現を免疫組織化学およびin situ hybridizationで行い野生型コントロール群と比較する。さらに、味蕾に侵入する神経線維をS100などで同定し、BDNFレセプターであるTrkBの発現を確認する。次に、舌に甘味・苦味刺激を行い、脳におけるc-Fosの発現から、神経伝達性を明らかにする。この検討においてACE2の発現低下が味細胞の機能低下を引き起し神経伝達への影響を引き起しているかを確認する予定である。
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| Causes of Carryover |
不死化味細胞株の培養実験が当初の予定よりも遅れたため、今年度予定していた味細胞の遺伝子発現解析に必要なPCRプライマーやタンパク質発現解析に必要な抗体の購入を一部見送った。そのため次年度使用額が生じた。次年度以降、味細胞株の培養実験が軌道に乗れば、今年度予定していた各種プライマーや抗体を購入する。そして翌年度分として請求した助成金では当初の予定通り、その他の培養実験、動物実験に必要な試薬を購入する。
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