2022 Fiscal Year Research-status Report
Development of novel cancer therapy targeting the interaction of the HSP40 family with mutant p53
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21K09855
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
戒田 篤志 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 講師 (40632097)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 頭頸部がん / p53 / HSP40ファミリー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
p53の安定化に寄与し得るHSP40ファミリーメンバーを同定すべく、2021年度より変異p53の蛍光標識ベクターの作製を試みてきた。p53R175H変異に対して蛍光タンパク質であるAcGFPをN末端側またはC末端側に融合したベクターをそれぞれ作製し、その機能性について検討したところ、C末端側に融合した際に内因性変異p53に類似した挙動を示すことが明らかになったため、p53R175H-AcGFPベクターを使用してHSP40ファミリーメンバー同定のためのスクリーニングを行った。具体的には各HSP40に対するsiRNAをデザインし、上記ベクターを頭頸部扁平上皮癌細胞株であるHN31細胞のp53ノックアウト株に導入した細胞に対して各siRNAを作用させた際にGFP発現がどのように変化するかを自動顕微鏡観察システム下にて検討を行った。その結果、一部のHSP40ファミリーメンバーにおいて20％前後の発現低下が認められたものの、その変化はわずかであった。
上記ベクターでは、p53安定化に対してcriticalな作用を示し得るHSP40を同定できなかったため、変異p53(C176F)を発現しているHN31細胞を用い、各siRNAを作用させ、p53に対する蛍光免疫染色後にその蛍光発現から内因性の変異p53発現の変化について解析した。その結果、少なくとも6種類のHSP40に対するsiRNAで処理した際ににおいて30～60％程度の発現低下が認められた。現在、p53安定化因子候補として同定されたHSP40についてvalidationを行っているところである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初、変異p53と蛍光タンパク質を融合したベクターを作製・使用し、スクリーニングを行う予定であったが、実際に行った結果、p53発現に有意な変化をもたらすHSP40を同定することができなかった。そこで、内因性変異p53の発現を指標にしたスクリーニングを改めて実施し、その結果、少なくとも6種類の候補因子を同定した。当初の実験計画とは異なる点もあったが、スクリーニングにおいて候補因子を同定できたという点から上記評価とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
スクリーニングにて同定されたHSP40についてvalidationを行う予定である。具体的には、ウェスタンブロッティングによるタンパク質発現解析、共免疫沈降によるp53との結合の有無、他配列のsiRNAによっても同様の効果が認められるかについて検討し、真にp53の安定化に寄与し得るHSP40の同定を試みる。
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