2022 Fiscal Year Research-status Report

非定型NLRP3インフラマソーム活性化機構に着目した歯周炎症反応制御に関する研究

Research Project

Project/Area Number	21K09887
Research Institution	Fukuoka Dental College
Principal Investigator	金子高士福岡歯科大学, 口腔歯学部, 教授 (10284697)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	吉永泰周福岡歯科大学, 口腔歯学部, 准教授 (60452869)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Keywords	NLRP3 / カスパーゼ４ / カスパーゼ５ / カスパーゼ１ / ピロトーシス / LPS / Porphyromonas gingivalis
Outline of Annual Research Achievements	歯周病原細菌のLPSとそれに対する生体防御反応により産生されるIL-1βは歯周炎の発症・進展に深く関連している。しかしながら歯周病現細菌のLPS刺激により誘導されたIL-1β前駆体が、どのようにしてカスパーゼ1によるプロセッシングをうけて活性化IL-1βになるかは不明のままであった。近年の炎症性カスパーゼのカスパーゼ4とカスパーゼ5がLPSの細胞内受容体として同定され、それらの活性化を介してNLRP3インフラマソームそしてカスパーゼ1を活性化する経路が報告された(非定型NLRP3活性化経路)。そこで本研究では様々な構造を持つ歯周病原細菌のLPSによるIL-1β活性化における非定型NLRP3活性化経路の役割を明らかにするとともに、カスパーゼ4, 5活性化経路へ介入し、IL-1β活性化やピロトーシスを制御することにより歯周炎をコントロールする可能性を探ることとした。ヒト単球/マクロファージ細胞株であるTHP-1細胞を用いて実験を行った。RT-PCR解析によりTHP-1細胞はNLRP3、カスパーゼ1、カスパーゼ4のmRNAを発現していたが、カスパーゼ5のmRNAは発現していなかった。Echerichia coliとPorphyromonas gingivalisのLPSを用いたTHP-1細胞へのエレクトロポレーションはLPS濃度依存的にTHP-1細胞死を誘導し、それはNLRP3、カスパーゼ1、カスパーゼ4の各インヒビターにより有意に抑制された。Western blottingによる解析では、両LPSによるエレクトロポレーションはカスパーゼ4とカスパーゼ1のデグラデーションを誘導した。またカスパーゼ４欠損THP-1細胞における両LPSのエレクトロポレーションは細胞死を誘導できなかった。以上のことからP.gingivalisによるピロトーシスにはカスパーゼ4が関与していることが示唆された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason THP-1細胞を用いたエレクトロポレーションによるLPS細胞内配送とLDH活性を指標としたピロトーシス測定のの実験条件を決定することができた。自前によるCRISPR/Cas9を用いたカスパーゼ４の遺伝子欠失は失敗したが、購入したカスパーゼ４欠損THP-1細胞を用いて実験を遂行できた。また各種インヒビターを用いた実験から非定型NLRP3活性化がP.gingivalisLPSによるピロトーシス誘導に関与することを明らかすることができた。
Strategy for Future Research Activity	今後はリコンビナントカスパーゼ4とP.gingivalis LPSの結合アッセイを行う。カスパーゼ５の誘導に関する実験を行う。
Causes of Carryover	本年度後半は福岡歯科大学口腔医療センターの移転、引越しのため実験の進行が思うように遂行できなかった。