Study of exosomes from cells in periodontal tissues with diabetes-associated periodontitis

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K09895
• Research Institution: The University of Tokushima
• Principal Investigator: 生田 貴久 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学域), 助教 (00746563)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 木戸 淳一 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学域), 准教授 (10195315) ; 稲垣 裕司 徳島大学, 病院, 講師 (50380019) ; 湯本 浩通 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学域), 教授 (60284303) ; 廣島 佑香 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学域), 講師 (60545143) ; 木戸 理恵 徳島大学, 病院, 助教 (60876027)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: エクソソーム / 糖尿病関連歯周炎 / 高グルコース / 歯周医学 / 歯周病原細菌 / AGEs

Outline of Annual Research Achievements

初年度として細胞由来エクソソームを抽出するための歯周組織由来細胞の選定、抽出方法の選択および抽出したエクソソームの部分的な同定分析を行った。すなわち、ヒト由来歯肉線維芽細胞（CRL2014）、歯根膜線維芽細胞および歯肉上皮細胞の内、糖尿病合併症研究に用いられる高グルコースやAdvanced glycation end-products (AGEs)に反応が認められた歯肉線維芽細胞を用いて研究を行った。培養した歯肉線維芽細胞からエクソソームを抽出する方法について検討を行ったところ、PureExome(R) Isolation kitを用いて、培養培地4 mLから約100 μLのエクソソーム画分を含む抽出液を回収した。
この抽出中のエクソソームの特徴を調べるために粒度解析を行ったところ（外部分析会社依頼）、平均粒子径が116.7 nmで、濃度が4.71 x 108 particles/mLであり、一般的なエクソソームの粒子径の50～150 nmと類似した粒子径であることがわかった。また、抽出液の総蛋白濃度は0.2～0.25 mg/mLであった。この抽出液を用いてエクソソームのマーカーとされるCD9について特異抗体を用いたウェスタンブロット分析（WB）を行ったがCD9に相当する分子量部位に明らかなバンドが認められず、今後の再度のWBを行う予定である。
また、現在、歯肉線維芽細胞を高グルコースおよびAGEsで刺激し、回収した細胞培養培地からエクソソームを抽出し、核酸や蛋白質の網羅的解析を行う準備を行っている。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

計画していた研究進行から遅れている状況である。当初、歯周組織細胞から適切にエクソソームを抽出し、その成分の各種抗体を用いたWB分析やELISAを予定していたが世界中の新型コロナウイルス感染拡大による物流の停滞により、海外製品の納品が著しく遅延した。また、２０２１年度後半に抽出したエクソソーム含有液のDNAや蛋白質のマイクロチップなどを用いた網羅的解析を予定していたが、これらの複数の分析会社の分析受託が込み合っているとのことで昨年度中に分析ができなかった。

Strategy for Future Research Activity

２０２１年度に実施できなかった実験について、今後、高グルコースやAGEs刺激した歯肉線維芽細胞由来エクソソームの核酸や蛋白質の網羅的な分析を行うとともに、これらの結果から得られた各種成分のWBやELISAを用いた同定を行い、高グルコースやAGEs刺激によるエクソソーム成分の変化について調べる予定である。
また、本来２０２２年度に予定していた歯肉線維芽細胞から抽出したエクソソーム画分の口腔上皮細胞、歯根膜線維芽細胞、骨芽細胞/破骨細胞および血球系細胞などに対するサイトカインや酸化ストレスなどの発現への影響、細胞分化への影響などについても検討を行う予定である。

Causes of Carryover

(理由)
計画していた研究進行から遅れている状況にあり、当初、歯周組織細胞から適切にエクソソームを抽出し、その成分の各種抗体を用いたWB分析やELISA、また、２０２１年度後半に抽出したエクソソーム含有液のDNAや蛋白質のマイクロチップなどを用いた網羅的解析を予定していたが実施できていないため。

（使用計画）２０２１年度に実施できなかった実験について、今後、高グルコースやAGEs刺激した歯肉線維芽細胞由来エクソソームの核酸や蛋白質の網羅的な分析を行うとともに、これらの結果から得られた各種成分のWBやELISAを用いた同定を行い、高グルコースやAGEs刺激によるエクソソーム成分の変化について調べる予定である。また、本来２０２２年度に予定していた歯肉線維芽細胞から抽出したエクソソーム画分の口腔上皮細胞、歯根膜線維芽細胞、骨芽細胞/破骨細胞および血球系細胞などに対するサイトカインや酸化ストレスなどの発現への影響、細胞分化への影響などについても検討しており、翌年度分として請求した研究費とあわせてその費用に使用する予定である。