2021 Fiscal Year Research-status Report
Novel strategy for periodontal tissue regeneraion using dead cell-derived signals
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21K09906
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| Research Institution | Osaka Dental University |
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Principal Investigator |
岩崎 剣吾 大阪歯科大学, 歯学部, 准教授 (40401351)
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2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 歯周組織再生 / 歯根膜 / 細胞死 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
歯周病は主にグラム陰性菌の感染による歯周組織の慢性炎症を特徴としている。進行した歯周病では慢性炎症によって歯周組織が破壊され、最終的には罹患歯は抜歯が必要となる。これまで歯周組織を再生する試みが多数行われ臨床応用された方法も数々存在するが、未だ組織再生量、適応症例の幅には限界があり、新規再生治療法に対するニーズは依然として大きい。我々はこれまで間葉系幹細胞および、その液性因子を実験動物に作製した歯周組織欠損モデルへ移植することにより、新生歯周組織の形成が誘導されることを見出し報告してきた。本研究課題は間葉系幹細胞に細胞死を誘導した際に放出される種々の因子を用いた新たな歯周組織再生治療法の可能性について検討することを目的としている。
骨髄由来間葉系幹細胞にネクローシスを誘導し細胞抽出物を回収した。歯周組織の創傷治癒過程における組織再生につながる組織反応として、創傷治癒の場への歯根膜細胞の増殖が重要であることから、間葉系幹細胞由来細胞抽出物の歯根膜由来細胞への影響を検討した。その結果、細胞抽出物は歯根膜由来細胞の増殖を有意に増強した。また、増殖期細胞のマーカーであるKi67を発現する細胞数の増加も確認された。この細胞増殖の増強は細胞抽出物のタンパク濃度依存的であり、また細胞抽出物の熱処理によって消失することが明らかとなった。細胞抽出物のタンパク分画の解析では多数のタンパク成分が含まれていることが確認された。また、タンパク合成阻害剤を作用させた間葉系幹細胞から得られた細胞抽出物では細胞増殖活性が有意に減弱していた。
今後、細胞抽出物の作用によって歯根膜細胞に生じる変化をin vitroの実験を用いて明らかとし、さらに細胞抽出物による歯周組織再生の可能性について動物実験を用いて検討する予定である。また、アポトーシスを誘導した際に得られる細胞由来因子の作用についても実験を開始する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
間葉系幹細胞として不死化骨髄間葉系幹細胞(UE7T-13)を培養し、freeze-thaw cycleによってネクローシスを誘導し、遠心処理とフィルトレーションを介して細胞抽出物を回収した。歯周組織再生において重要な役割を果たす細胞である歯根膜細胞はLonzaより購入し培養し実験に用いた。細胞抽出物を歯根膜細胞へ作用させ、細胞増殖について検討したところ、細胞抽出物を作用させた歯根膜細胞の細胞増殖に有意な増強が見られた。この細胞増殖の増強は細胞抽出物のタンパク濃度に依存して増加していた。また、増殖期細胞のマーカーであるKi67の発現を免疫染色法にて検討したところ、細胞抽出物を作用させた歯根膜細胞ではKi67陽性細胞数が増加することが確認された。細胞抽出物をSDS-PAGEにて展開すると数KDa～数百KDaに渡る数多くのタンパクのバンドが認められた。次に、細胞抽出物に対してタンパク変性を生じる熱処理を行い、歯根膜細胞へ作用させたところ細胞増殖の増強作用が消失することが明らかとなった。さらに、骨髄間葉系幹細胞にタンパク合成阻害剤であるCycloheximide（CHX）を作用させた後に細胞抽出物を回収し、歯根膜細胞の増殖への影響を検討した。その結果、CHXを作用した細胞由来の抽出物は歯根膜に対する増殖活性が著しく減少することが確認された。また、細胞抽出物のタンパク質成分を詳細に解析する目的で液体クロマトグラフ質量分析を行ったところ、数多くの細胞骨格タンパク、細胞外マトリクスタンパク、酵素が含まれていることが明らかとなった。
これらの実験結果から骨髄間葉系幹細胞より得られる細胞抽出物はそのタンパク成分を介して歯根膜細胞の増殖を促進することを示していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究初年度には間葉系幹細胞のネクローシスを介して回収される細胞抽出物が、歯周組織再生のカギを握る歯根膜細胞の増殖を誘導すること、そしてその増殖誘導活性が細胞抽出物に含まれるタンパク成分によることを明らかとした。今後、タンパク成分の詳細な検討を目的として、タンパクアレーなどの網羅的な解析方法を用いて内容物の解析を進める。また、歯根膜細胞において間葉系幹細胞由来細胞抽出物がどのような変化をもたらしているかについて検討するために、細胞抽出物を作用させた歯根膜細胞での遺伝子変化について、こちらも網羅的に解析する予定である。次世代シークエンサーを用いたRNA-sequencing を計画している。歯根膜細胞の細胞増殖と同様に、細胞遊走についても歯周組織再生に大きく関与する現象であるとわかっていることから、細胞抽出物の歯根膜細胞遊走への影響についても実験を行う。さらに、より直接的な歯周組織再生の検討方法として、実験動物に作製した歯周組織欠損内へ間葉系幹細胞抽出物を直接投与し、実際に歯周組織再生が誘導されるか否かについて動物実験を行い検証する予定である。
また、ネクローシスと対をなす細胞死の様式であるアポトーシスについても同様に歯根膜細胞への影響を検討する予定である。まず細胞増殖への影響、遺伝子レベルでの変化を実験する予定である。
これらの検討を行うことによって、間葉系幹細胞抽出物の細胞死を介して放出される因子を用いた、新規歯周組織再生治療あるいは創傷治癒促進療法の開発のための基盤となる実験データの収集を目指す。
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| Causes of Carryover |
2021年度からの繰り越しが発生したが、コロナウィルス感染症蔓延の影響で一時的に研究を停止していた時期があること、細胞を用いた研究が当初の予定よりも順調に進み、想定していた実験を行う必要がなくなったことが原因と考えられる。繰り越しの額は大きいものではなく、2022年度に行う動物実験の費用として使用する予定である。
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Research Products
(3 results)
